美廉净凝胶对宫颈炎的药效学探究

王雨佳 王梦如＃ 赵健铤金凡茂沈咏梅 刘 衡何 苗∗李 玥∗

（1.云南省昆虫生物医药研发重点实验室药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南大理 671000；2.药用美洲大蠊四川省重点实验室，四川成都 610000）

宫颈炎是女性生殖器官炎症中最常见且发病率较高的一种炎症反应，此炎症与创伤、细菌、病毒等感染密切相关。临床主要表现为阴道分泌物增多、宫颈出血、水肿等［1］。通常采用阴道局部给药，使药物通过阴道黏膜吸收进入局部组织或全身血液循环达到治疗目的［2］。凝胶剂是临床常用的阴道给药剂型，与人体组织有较好的生物相容性，对药物具有缓、控释作用，使局部病灶部位的有效浓度增加，提高了生物利用度，增强药物疗效［3］。美洲大蠊Periplaneta americana L.俗称蟑螂，属蜚蠊目、蜚蠊科、大蠊属昆虫，其入药始载于《神农本草经》，有散瘀、解毒、消肿、利水等功能［4］。研究发现，美洲大蠊提取物具有抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、促组织修复等多方面药理作用［5-6］。本实验从美洲大蠊醇提取物中纯化精制了抗炎活性部位［7］，制成美廉净凝胶。建立苯酚致大鼠宫颈炎模型并使用美廉净凝胶治疗，通过大鼠血清生化因子及宫颈组织病变评价其对宫颈炎的治疗作用，以期为宫颈炎的临床治疗提供新选择。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠，雌性未孕，体质量220～240 g，昆明医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（滇）2011-0004，饲养于大理大学实验动物中心清洁级动物房。

1.2 药物与试剂 美洲大蠊浸膏（大理大学昆虫生物医药研究院张成桂副教授提供，批号1161-723-GZG，按照中国发明专利CN1943600“含有美洲大蠊及其乙醇提取物的药物组合物及新用途”方法制备）；苯酚（西陇化工股份有限公司，批号CAS108-95-2）；羧甲基纤维钠（国药集团化学试剂有限公司，批号F20110509）；丙三醇（天津市福晨化学试剂厂，批号20130107）；异氟烷（山东科源制药有限公司，批号131101）；水合氯醛（天津市光复精细化工研究所，批号20120619）；无水乙醇（天津市瑞金特化学品有限公司，批号20130124）；冰醋酸（天津市瑞金特化学品有限公司，批号20130104）；复方地塞米松凝胶（厦门金日制药有限公司，批号130603）；椿乳凝胶（株洲千金药业股份有限公司，批号20130113）；泊洛沙姆P407（德国BASF SE 公司，批号WPEH540B）；泊洛沙姆P188（德国BASF SE 公司，批号WPYH570B）；铜蓝蛋白试剂盒（CP，批号20130125）、总超氧歧化酶试剂盒（T-SOD，批号20130202）、丙二醛试剂盒（MDA，批号20130110）均购于南京建成生物科技有限公司。

1.3 仪器 METTLERAE240 精密电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；RB-200 智能热板仪（成都泰盟科技有限公司）；2010 型酶标仪（奥地利安图斯公司）；ES-1450 型高压灭菌锅（日本Tomy Kogyo 公司）；TL-16R 台式高速冷冻离心机（上海市离心机械所）；APS-300S 型自动脱水机（德国Leica 公司）；BM-VIII 型生物组织包埋机、冷冻台（孝感市宏业医用仪器有限公司）；RM2245 型手动切片机（德国Leica 公司）；YT-7FB 型生物组织摊烤片机（湖北省孝感市亚光医用电子科技有限公司）；BI-2000 型医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.4 受试药物配制 空白凝胶，称取适量的泊洛沙姆P407、P188 固体，加足量水溶胀24 h，加适量乙醇、甘油，搅拌，混匀，于4 ℃静置24 h，密封，备用。美廉净凝胶，按上述方法制备空白凝胶，加入美洲大蠊浸膏，制备成美廉净高（150 mg／mL）、中（100 mg／mL）、低（50 mg／mL）凝胶，密封，备用。

1.5 造模试剂（20%苯酚胶浆制备）量取50 ℃液态苯酚4 mL、1 g 羧甲基纤维钠，6 mL 甘油在50 ℃的水浴中充分搅拌均匀，再加入9 mL 蒸馏水稀释混匀，配制20%苯酚胶浆，密封4 ℃冰箱保存，实验时放置室温混匀使用［8-9］。

2 方法

2.1 造模 根据参考文献［10-11］建立大鼠宫颈炎模型。从80 只雌性未孕SD 大鼠中随机挑选10 只作为正常对照组，其余70 只用于造模。异氟烷将大鼠进行麻醉，用带有灌胃钝性针头的一次性注射剂器将20%的苯酚胶浆缓慢注入大鼠宫颈穹隆部腔内，0.1 mL／只，后将大鼠头低尾高体位倾斜放置5 min，每3 d 按上述方法操作1 次，连续3 次，造模时间共12 d。

2.2 分组及给药 造模结束后第3 天，参考《中药药理研究方法学》［12］中“中药阴道用制剂毒性试验方法”的炎症程度进行评分（表1），根据红斑、水肿、分泌物的总分进行疗效统计学分析，并以总分0～3 分为无炎症、4～6 分为轻度炎症、7～9 分为中度炎症、10～12 分为重度炎症。分组时将无炎症大鼠剔除，剩余大鼠按炎症严重程度分层随机分为凝胶组、模型对照组、复方地塞米松凝胶组（1.5 mg／kg）、椿乳凝胶组（1.0 g／kg）、美廉净凝胶高（75 mg／kg）、中（50 mg／kg）、低（25 mg／kg）剂量组，每组10 只。分组后第1 天开始阴道内给药，每天给药2 次，正常对照组和模型对照组按上述给药方式给予相应的生理盐水，连续给药10 d。

2.3 取样及指标检测 在给药治疗期间，观察大鼠的一般症状，包括形态外观、行为活动、饮食、饮水及自主活动功能等有无异常；观察大鼠阴道及宫颈口红斑、水肿及分泌物，并给予评分，评分标准见表1。末次给药后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，冰水浴放置4～6 h，4 ℃、3 500 r／min、离心10 min，取上层血清适量，按照CP、MDA、T-SOD 试剂盒说明书，依次加入试剂，37 ℃孵育显色，加入终止液，酶标仪测定OD 值；取大鼠肝脏、肾脏和宫颈组织，于生理盐水中浸洗2～3次，滤纸吸干水分，称定质量，脏器指数＝相应脏器质量（mg）／大鼠处死前体质量（kg）×100%；完整分离各组大鼠宫颈组织，经10%的福尔马林固定、梯度脱水、石蜡包埋、切片、苏木精／伊红染色、封片，显微镜下观察宫颈组织的病理变化。

表1 外阴炎症反应评分标准

2.4 统计学分析 采用统计分析软件SPSS 17.0 进行统计学处理，数据以（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐，组间两两比较采用LSD 法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 美廉净凝胶对宫颈炎大鼠一般状态的影响 造模期间，与正常对照组比较，各造模组大鼠饮食量减少，喜扎堆、竖毛、易怒，外阴及宫颈口可见明显的红肿，并伴有大量黄色或白色甚至血丝的黏性分泌物。经药物治疗后，与模型对照组比较，各给药组大鼠上述症状均得到不同程度的改善。其中美廉净凝胶高剂量组药效最佳。

3.2 美廉净凝胶对宫颈炎大鼠外阴炎症程度的影响 给药前，模型组各组间外阴炎症评分无差异。与正常对照组比较，模型对照组外阴炎症评分升高（P＜0.01）；在给药第10 天，与模型对照组比较，复方地塞米松凝胶组、椿乳凝胶组及受试药各剂量组外阴炎症评分降低（P＜0.01），凝胶组差异无统计学意义（P＞0.05）；与凝胶组比较，各给药组外阴炎症评分降低（P＜0.01）。综上，本模型造模成功，且空白凝胶对模型不会产生显著影响。见表2。

表2 美廉净凝胶对苯酚致宫颈炎大鼠外阴炎症的影响（，n＝10）

表2 美廉净凝胶对苯酚致宫颈炎大鼠外阴炎症的影响（，n＝10）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型对照组比较，∗∗P＜0.01；与空白凝胶组比较，▲▲P＜0.01。椿乳凝胶组给药剂量为凝胶质量计算。

3.3 美廉净凝胶对宫颈炎大鼠脏器指数的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾脏指数、宫颈指数升高（P＜0.01）；与模型组对照组比较，美廉净凝胶各剂量组肾脏指数、宫颈指数均有下降趋势，肝脏指数差异无统计学意义（P＞0.05）；与凝胶组比较，复方地塞米松凝胶组、美廉净凝胶高剂量组宫颈指数不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 美廉净温度敏感型凝胶对苯酚致宫颈炎大鼠脏器指数的影响（，n＝10）

表3 美廉净温度敏感型凝胶对苯酚致宫颈炎大鼠脏器指数的影响（，n＝10）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与空白凝胶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.4 美廉净凝胶对宫颈炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组CP、MDA、T-SOD表达升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，各给药组CP、MDA、T-SOD 表达均有不同程度的降低，其中MDA、T-SOD 表达降低（P＜0.05，P＜0.01）；与凝胶组比较，复方地赛松凝胶组CP、T-SOD 表达降低（P＜0.01），美廉凝胶高剂量组CP、MDA 表达水平有不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），见表4。

表4 美廉净温度敏感型凝胶对苯酚致宫颈炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影响（，n＝10）

表4 美廉净温度敏感型凝胶对苯酚致宫颈炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影响（，n＝10）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型对照组比较，∗∗P＜0.01；与空白凝胶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.5 美廉净凝胶对宫颈炎大鼠宫颈组织病理学的影响 正常对照组宫颈及阴道壁组织结构正常各层清晰可见，未见鳞状上皮增生和破损，未见柱状上皮鳞状化，鳞柱移行处结构正常，宫颈黏膜下及阴道壁黏膜组织内有少许淋巴细胞和中性粒细胞分散浸润；模型对照组和空白凝胶组可见宫颈黏膜鳞状上皮增生，阴道壁浅表有溃疡形成，组织中有大量中心粒细胞和淋巴细胞浸润，可见血管充血及组织细胞状态异常；复方地塞米松凝胶组和美廉净凝胶高、中剂量可见宫颈黏膜各层组织结构清晰，宫颈黏膜下层及阴道壁黏膜组织中有少量的中性粒细胞和淋巴细胞浸润，其中复方地塞米松凝胶组趋于正常黏膜下白细胞数明显少于高、中剂量组；椿乳凝胶组和美廉净凝胶低剂量组可见宫颈黏膜有上皮增生的现象，黏膜下有较多量的中性粒细胞和淋巴细胞浸润，组织及血管有异常。见图1。

图1 各组大鼠宫颈组织病理切片图（HE，×400）

4 讨论

本实验采用经典苯酚胶浆化学灼伤致宫颈炎模型，造模后，各造模大鼠主要一般表现为阴道红肿、分泌物增多，与临床宫颈炎患者相似［13］。经美廉净凝胶各剂量组治疗后，模型大鼠的红肿减轻、分泌物也有减少的迹象，显示实验药物对宫颈炎大鼠有一定的治疗作用。

虽然由于高分子辅料组成的空白凝胶有一定的促进组织修复及抑制炎症的作用，但药物治疗组与凝胶组比较存在显著性差异，证实了美蠊浸膏在治疗宫颈炎过程中发挥了主要作用。

当机体发生炎症和组织坏死时，血清中作为炎症反应指标之一的CP 活力会增强［14］，同时体内的超氧自由基会增多，产生的MDA 升高，使SOD 活力降低［15］，故检测血清中的CP、T-SOD 及MDA 对评价炎症的程度有重要意义。本研究中，CP、MDA 表达量降低，T-SOD 表达量升高。提示美廉净凝胶可能降低炎性因子的表达，调节氧自由基含有量，进而起到治疗宫颈炎的作用。

基于以上研究，可见美廉净凝胶在一定程度上有减轻炎性症状的作用，但是主要是针对轻、中度的宫颈炎模型进行研究，而且宫颈炎并不是单一因素引起的炎症，可能还有很多微生物参与炎症的发展。后期，课题组将进一步研究美廉净凝胶对不同致病机理的大鼠宫颈炎的治疗作用，考察美廉净抗宫颈炎的药效学机制。