淡黄裂孔菌和硫色小木层孔菌发酵液化学成分的研究

王 双，字洪芳

（大理大学药学院，云南大理 671000）

淡黄裂孔菌Schizopora flavipora（Berk.＆ M.A.Curtis ex Cooke）Ryvarden（syn. Poria flavipora）和硫色小木层孔菌Phellinidium sulphurascens（Pilát）Y.C.Dai（syn. Coniferiporia sulphurascens）均为严重的森林病原菌，常生长在针叶树上，可引起木材的白色腐朽及森林大面积死亡［1-3］。淡黄裂孔菌和硫色小木层孔菌均为锈革孔菌目真菌，前者隶属于裂孔菌科、裂孔菌属［4］，后者隶属于锈革孔菌科、小木层孔属［5］。

目前对2 种真菌化学成分的研究较少，硫色小木层孔菌中主要含有血苋烷型倍半萜［6］。本课题组在寻找高等真菌中活性成分的过程中［7-8］，对这2种白色腐朽真菌的发酵液进行化学成分初探，从淡黄裂孔菌中分离得到了2 个氧杂蒽酮类化合物，其中化合物1 为新化合物。从硫色小木层孔菌中分离得到了异地花菌素和2 个血苋烷型倍半萜化合物。

在深入研究云南高等真菌的代谢产物过程中，为寻找更多的结构新颖和具良好活性的先导化合物，OSMAC 是一种有效的策略［9］。OSMAC 策略强调通过改变培养基成分、培养条件和添加酶抑制剂等干扰因素来刺激微生物，激活不同的合成基因簇，挖掘其产生不同次级代谢产物的能力，从而获得骨架新颖、活性高的新化合物。本研究在OSMAC 策略指导下对淡黄裂孔菌和硫色小木层孔菌2 个较稀有高等真菌进行次级代谢产物初步探索，从中分别得到了氧杂蒽酮类、地花菌素类和血苋烷型倍半萜类，氧杂蒽酮类化合物可与不同的靶标作用而具有广泛的生物活性，曾被药物化学家称为“特权结构”［10］；地花菌素类化合物则因其抗癌活性、抗HIV 活性而备受关注［11-12］；部分血苋烷型倍半萜化合物则具抗真菌作用［13］或对植物病原菌的孢子萌发有显著抑制活性［14］。根据OSMAC策略原理，此次初步研究结果提示这2 种高等真菌具有潜在的合成基因簇、值得更深入地挖掘。在后期研究中可通过扩大发酵液培养规模、改变培养基成分和培养条件等措施而获得更多活性分子。

1 材料

Bruker DRX-500 和AM-400 型核磁共振谱仪（TMS 为内标，德国Bruker 公司）；液相四级杆飞行时间质谱仪（美国领先仿生有限公司）；Agilent 1200 HPLC、Agilent Zorbox SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（美国安捷伦公司）；制备柱Zorbax SB-C18（21.2 mm × 150 mm，5 μm）；Sephadex LH-20 凝胶（瑞典Amersham Biosciences公司）；RP-18 反相硅胶Chromatorex（40～75 μm，日本Fuji 公司）；正相硅胶（80～100、200～300目）、GF254TLC 板（青岛海洋化工厂）。

显色方法为荧光灯254、365 nm 波长下观察荧光，碘蒸气显色，10% 浓硫酸香草醛处理后加热显色。

淡黄裂孔菌的子实体于2008 年采自湖北省神农架，硫色小木层孔菌的子实体于2009 年采自吉林省安图县长白山自然保护区，两者均由中国科学院昆明植物研究所杨祝良研究员鉴定为正品。

2 培养与发酵

2 种真菌的发酵均采用斜面转三角瓶液体培养的方法。培养基为葡萄糖20 g、去皮土豆200 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g、VB110 mg，加水混合搅拌至1 000 mL。500 mL 三角瓶装300 mL 液体培养基，接种量为10%，25 ℃下150 r／min 摇床上培养25 d。

3 提取与分离

淡黄裂孔菌发酵液（20 L）滤除菌丝体后浓缩至5 L，用乙酸乙酯萃取3 次，合并提取液蒸干得浸膏15.5 g。然后，经正相硅胶柱色谱（200～300目）、石油醚-丙酮（9 ∶1～1 ∶1）梯度洗脱，按香草醛浓硫酸等显色结果合并得到6 个组分（A～G）。其中组分C 经Sephadex LH-20 氯仿-甲醇（1 ∶1）、正相硅胶色谱柱石油醚-乙酸乙酯（9 ∶1～3 ∶1）梯度洗脱，再经制备HPLC 乙腈-水（30%～60%）梯度洗脱得到化合物1（2.3 mg）、2（2.4 mg）。

硫色小木层孔菌发酵液（21 L）滤除菌丝体后浓缩至5 L，用乙酸乙酯萃取3 次，合并提取液蒸干得浸膏42.5 g。然后，经正相硅胶柱色谱（200～300 目）、石油醚-丙酮（9 ∶1～1 ∶1）梯度洗脱，按香草醛浓硫酸等显色结果合并得到6 个组分（A～G）。组分C 经Sephadex LH-20 氯仿-甲醇（1 ∶1）、正相硅胶氯仿-乙酸乙酯（20 ∶1～5 ∶1）梯度洗脱、常压反相硅胶柱甲醇-水（40%～90%）梯度洗脱、制备HPLC 乙腈-水（40%～70%）梯度洗脱得化合物4（3.2 mg）、5（2.4 mg）；组分D石油醚-丙酮（4 ∶1）经硅胶柱氯仿-乙酸乙酯（20 ∶1～4 ∶1）、Sephadex LH-20 氯仿-甲醇（1 ∶1）和制备HPLC 乙腈-水（35%～65%）梯度洗脱得化合物3（4.1 mg）。

4 结构鉴定

化合物1：黄色粉末。通过高分辨质谱HRESI-MS m／z：279.063 3，分子式C15H12O4，不饱和度为10。从13C-NMR 谱中（表1）可见15 个碳信号，由DEPT 谱可知其中有2 个甲基（其中1个连氧）、5 个次甲基、8 个季碳（包括1 个共轭羰基）；1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）进一步确定了甲氧基、甲基及羟基（9.88，1H，brs）的存在，除此之外只余5 个芳香氢信号，结合饱和度和碳谱信息，猜测结构母核可能为杂氧蒽酮［15］。从1HNMR 谱中δ 7.39（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-8），7.36（1H，d，J ＝8.0 Hz，H-5），7.19（1H，dd，J ＝8.0，2.0 Hz，H-6）信号特别是峰形可知，该苯环为1，2，5 三取代，另外2 个氢信号6.89（1H，s H-4），6.76（1H，s，H-2）所在苯环为1，2，3，5 四取代，2 个氢为间位取代。根据HSQC 信号可知H-1′（3.85，3H，s）与C-1′（56.0，q）相连、H-3′（2.39，3H，s）与C-3′（21.9，q）相连、H-2（6.76，1H，s）与C-2（109.5，d）相连、H-4（6.89，1H，s）与C-4（108.8，d）相连、H-5（7.36，1H，d，J ＝8.0 Hz）与C-5（123.0，d）相连、H-6（7.19，1H，dd，J ＝8.0，2.0 Hz）与C-6（123.3，d）相连、H-8（7.39，1H，d，J ＝2.0 Hz）与C-8（109.0，d）相连。根据HMBC 谱信号，羟甲基H-1′与C-1（160.0，s）关联，甲基H-3′与C-3（146.5，s）、C-2（109.5，d）、C-4（108.8，d）关联，H-2 与C-1（160.0，s）、C-3、C-9a（107.0，s）、C-3′（21.9，q）、C-4 关联，H-4 与 C-4a（157.4，s）、C-3、C-3′、C-2 关联，可知化合物1的1 位被羟甲基取代、3 位为甲基取代。根据HMBC 谱信号，H-5 与C-4b（147.9，s）、C-6、C-7（153.7，s）、C-8a（118.7，s）关联，H-6 与C-5、C-7、C-4b、C-8 关联，H-8 与C-7、C-8a、C-6、C-9（174.3，s）关联，可知化合物1 的7 位被羟基取代。此外，化合物1 与已知化合物1，7-dihydroxymethylxanthone［16-17］区别尽在甲基取代，至此化合物1 的结构确定为1-methoxy-7-hydroxy-methylxanthone，为新化合物。

表1 化合物1 的NMR 数据（DMSO-d6）Tab.1 NMR spectral data of compound 1（DMSO-d6）

化合物2：黄色粉末，ESI-MS m／z：265.0［M+Na］+，分子式C14H10O4。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6） δ：7.51（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-8），7.41（1H，d，J ＝8.0 Hz，H-5），7.33（1H，dd，J ＝8.0，2.0 Hz，H-6），6.86（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-4），6.62（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-2），2.37（3H，s，H-3′）；13C-NMR（500 MHz，DMSO-d6） δ：181.4（s，C-9），160.9（s，C-1），156.1（s，C-4a），154.4（s，C-7），149.6（s，C-4b），149.3（s，C-3），125.7（d，C-6），120.8（d，C-5），119.7（s，C-8a），110.8（d，C-2），108.1（d，C-8），107.8（d，C-4），106.2（s，C-9a），22.4（q，C-3′）。以上数据与文献［16-17］报道一致，故鉴定为1，7-dihydroxymethyl-xanthone。

图1 化合物1 结构及其HMBC 相关图Fig.1 Structures compounds 1 and its key HMBC correlations

化合物3：黄色油状物；分子式C22H32O2；ESI-MS m／z：351.2 ［M+Na］+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.26（1H，d，J ＝2.3 Hz，H-1），6.21（1H，d，J ＝2.3 Hz，H-3），5.14（1H，t，J ＝6.7 Hz，H-2′），5.07（1H，m，H-6′），5.06（1H，m，H-10′），3.29（2H，d，J ＝6.7 Hz，H-1′），2.23（3H，s，H-8），2.09（2H，m，H-8′），2.04（2H，m，H-4′），2.03（2H，m，H-5′a，9′a），1.96（2H，m，H-5′b，H-9′b），1.79（3H，s，H-15′），1.67（3H，s，H-12′），1.59（3H，s，H-13′），1.58（3H，s，H-14′）；13C-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：155.4（s，C-4），154.2（s，C-6），138.4（s，C-3′），137.6（s，C-2），135.4（s，C-7′），131.2（s，C-11′），124.4（d，C-10′），123.6（d，C-6′），121.6（d，C-2′），110.4（s，C-5），109.0（d，C-1），101.0（d，C-3），39.6（t，C-4′），39.5（t，C-8′），26.6（t，C-5′），26.3（t，C-9′），25.6（q，C-12′），22.1（t，C-1′），21.0（q，C-8），17.6（q，C-13′），16.2（q，C-15′），16.0（q，C-14′）。以上数据与文献［18-19］报道一致，故鉴定为异地花菌素。

化合物4：白色粉末；分子式15H26O2；ESI-MS m／z：261.2 ［M+Na］+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：5.52（1H，brs，H-7），3.85（1H，dd，J ＝11.0，2.5 Hz，H-11a），3.74（1H，dd，J ＝10.8，7.2 Hz，H-11b），3.25（1H，dd，J ＝10.6，5.1 Hz，H-3），2.00（3H，m，H-1a，H-6），1.83（1H，m，H-9），1.64（2H，m，H-2），1.23（1H，m，H-1b），1.77（3H，s，H-12），1.18（1H，m，H-5），0.97（3H，s，H-15），0.85（3H，s，H-14），0.84（3H，s，H-13）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：132.8（s，C-8），123.8（d，C-7），79.0（d，C-3），60.7（t，C-11），57.0（d，C-9），49.3（t，C-5），38.6（s，C-4），37.8（t，C-1），35.8（s，C-10），28.0（q，C-15），27.2（t，C-2），23.2（t，C-6），15.3（q，C-14），14.9（q，C-13）。以上数据与文献［20-21］报道一致，故鉴定为7-drimene-3，11-diol。

化合物5：白色粉末；分子式C15H26O3，ESIMS m／z：277.2 ［M+Na］+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：5.79（1H，brs，H-7），4.26（1H，d，J ＝12.8 Hz，H-12a），3.97（1H，d，J ＝12.8 Hz，H-12b），3.84（1H，dd，J ＝11.0，2.5 Hz，H-11a），3.63（1H，dd，J ＝10.8，7.2 Hz，H-11b），3.20（1H，dd，J ＝10.7，5.2 Hz，H-3），2.04（4H，m，H-1a，H-6，H-9），1.63（2H，m，H-2），1.31（1H，m，H-1b），1.24（1H，m，H-5），0.98（3H，s，H-15），0.88（3H，s，H-14），0.84（3H，s，H-13）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：138.6（s，C-8），126.4（d，C-7），79.7（d，C-3），66.9（t，C-12），61.3（t，C-11），55.8（d，C-9），50.8（t，C-5），39.9（s，C-4），39.0（t，C-1），36.7（s，C-10），28.8（q，C-15），28.2（t，C-2），24.4（t，C-6），16.0（q，C-14），15.1（q，C-13）。以上数据与文献［21-22］报道一致，故鉴定为7-drimene-3，11，12-triol。