松树蜂毒素腺解剖结构和毒素成分1)

王郑通 杨华巍

(中法欧亚森林入侵生物联合实验室(北京林业大学)，北京，100083) (江苏省太仓海关口岸生物安全防控实验室)

李碧鹰 任利利 石娟

(中国食品发酵工业研究院) (中法欧亚森林入侵生物联合实验室(北京林业大学))

随着国际经济一体化进程的加快，林业生物入侵形势愈发严峻。林业入侵物种对森林资源、物种多样性、生态环境以及经济安全造成了严重损害，防控入侵生物已成为全球的重大课题之一。

松树蜂(Sirexnoctilio)隶属于膜翅目(Hymenoptera)树蜂科(Siricidae)树蜂属(Sirex)，原产于欧亚大陆和北非，是林业上十分重要的害虫，也是国际重大检疫性害虫，先后入侵大洋洲、南北美洲和非洲的诸多国家，主要危害松属(Pinus)、冷杉属(Abies)等针叶树种，对当地造成重大的生态、经济损失[1-3]。松树蜂雌性成虫体内专门制造昆虫毒素的腺体被称为毒素腺，毒素腺分泌的毒素储存在一个被称为毒素囊的器官内，在松树蜂产卵时与卵一起通过产卵器注入寄主松树中[4]。毒素可降低松树的抗性，为松树蜂卵的发育提供条件，另外毒素也能促进松树蜂体内携带的一种共生真菌的生长[5]。研究表明，膜翅目昆虫的毒素是一种含有多种小分子质量物质和生物活性多肽的极其复杂的混合物，通过活性测定、基因序列比对分析及蛋白质组等方法，数余种酶类和毒素蛋白已被成功鉴定[6]。早期的研究学者指出松树蜂毒素是一种由黏多糖和蛋白质等物质组成的呈酸性的混合物，含有多种酶、活性多肽和其他小分子质量物质[7]，但没有对其成分做进一步分析。以往的研究对象主要集中在跟人类健康密切相关且有重大经济价值的种属，如蜜蜂科(Apidae)和胡蜂科(Vespidae)上，而对植物性寄生的树蜂毒素研究较少。

自2013年松树蜂入侵我国以来，有关其毒素腺的生理结构和毒素溶液有效成分的分析尚未见报道。鉴于此，笔者通过对松树蜂雌成虫腹部的解剖与观察，找到毒素囊和毒素腺的位置并分离提纯获得毒素溶液，同时，对松树蜂毒素腺的结构及其功能进行了分析。最后，利用气相色谱质谱联用仪得出GC-MS谱图，分析得到毒液各有效成分的种类，以期为明确松树蜂毒素的作用原理及了解松树蜂的致病机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 松树蜂雌成虫的解剖

试验所用虫体均来源于前期在各虫源地(黑龙江省杜蒙县、黑龙江省鹤岗市、内蒙古通辽市)采集的樟子松受害木段，待雌性成虫羽化后，放置冰箱中4 ℃保存待测，所有活虫试验均在北京林业大学植物检疫实验室内完成。

将待测松树蜂雌成虫取出后，用沾有体积分数96%酒精的小毛刷轻轻擦拭虫体进行消毒，并对解剖镜台面和解剖过程中使用的手术剪和昆虫针等实验用具进行消毒。用昆虫针将雌虫固定在蜡盘内，虫体背面朝上，放置在解剖镜(Lecia M205C,Germany)台面上，放大15～20倍。将手术剪的尖端轻轻插入虫体第8和第9腹板的结合处，剪断第8腹板，并顺着向上依次剪断第7至第2腹板；用昆虫针将剪断的腹板向两侧挑开并固定在蜡盘上；将背板下方的脂肪、肌肉以及结缔组织用昆虫针剔除干净；最后，将1对卵巢分开并拨向两侧，观察雌成虫内部的组织和器官。

1.2 松树蜂毒素成分分析

1.2.1 毒素溶液的制备

在完成了对松树蜂雌成虫腹部的解剖和贮菌囊的分离之后，用昆虫针将毒素腺和毒素囊一一挑出，随后立即装入1.5 mL的灭菌离心管并在-80 ℃保存，以备后用。毒素溶液的制备参考Bordeaux的方法[8]，将收集到的10头雌虫的毒素腺体和毒素囊集中在一起，称质量，加去离子水，用匀浆器(组织研磨器)研磨至悬浊液状态，稀释至20 g·L-1，17 000g离心8 min，取上清液，分装至1.5 mL灭菌离心管，-80 ℃保存备用。

1.2.2 样品预处理

以吴晨等[9]的方法对毒素溶液样品分别进行预处理。蛋白样品使用氨水萃取，萃取后蛋白质完全溶解于氨水，加入蛋白酶水解或5～10倍的体积分数20% HCl煮沸回流16～20 h，或加压于120 ℃水解12 h，将蛋白质水解成氨基酸。利用N-甲基-N-特丁基二甲硅烷基三氟乙酰胺(MTBSTFA)或N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)对水解产物进行硅烷化衍生，以降低水解产物的极性和气化温度，增加其化学稳定性。脂类样品使用乙醚、丙酮等有机溶剂萃取，萃取后使用KOH的甲醇溶液进行皂化甲酯化处理，水解产物经萃取，酸化等处理，使用MTBSTFA、BSTFA等试剂衍生。多糖类样品使用酸性水解试剂(三氟乙酸(TFA))水解，水解产物经离心沉淀过滤后，采用三甲基硅烷化和乙酰化衍生。

1.2.3 分析条件

采用赛默飞世尔TRACE ISQ气相色谱质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5色谱柱(30.00 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm)；进样口温度230 ℃，分流比1∶1，分流流量1 mL·min-1，FID检测器温度290 ℃；升温程序：初温50 ℃，保持0 min，然后10 ℃·min-1，到280 ℃，保持7 min；空气压力52 kPa，载气(高纯氮气)；总流速5 mL·min-1，吹扫流速3 mL·min-1；进样量1 mL[10-11]。

2 结果与分析

2.1 松树蜂毒腺的解剖结构

解剖结果显示了松树蜂雌成虫内部生殖系统的组织构造和结构特点以及贮菌囊(图1a，松树蜂雌性成虫体内贮藏共生真菌的囊状器官)、腹神经节(图1b)、毒素腺(图1c)和毒素囊(图1d)等重要组织和器官的分布位置。进一步观察发现：毒素腺位于产卵器(图1e)基部，为体积较小的腺体组织。毒素囊也位于产卵器基部附近的位置，与毒素腺相邻。与其他组织和器官相比，毒素囊占据了雌虫腹部相当大的空间，呈淡黄透明色，类似米粒大小的球状晶体，肉眼可见，毒素囊通过管状组织和松树蜂中输卵管相连成为雌虫生殖系统的一部分。值得注意的是松树蜂体内的管状组织将松树蜂的贮菌囊、毒素囊和生殖系统紧密地联系在一起，形成了一个类似“三通管”的结构，贮菌囊、毒素囊和卵巢(图1f)位于“三通管”的3个分支方向，3个分支最终汇集到中输卵管。这种组织结构方式保证了松树蜂雌虫在产卵时能够将卵巢中的卵、贮菌囊贮藏的共生菌菌丝片段(分节孢子)和毒素囊中的毒素一起注入寄主体内。

a.贮菌囊；b.腹神经节；c.毒素腺；d.毒素囊；e.产卵器；f.卵巢。(参照文献[12])。

2.2 松树蜂毒素成分

通过裂解气相色谱质谱试验，得到松树蜂毒素样品裂解气相色谱质谱联用仪谱图，其结果见图2。

通过气相色谱质谱试验，得到松树蜂毒素样品的气相色谱质谱联用仪谱图，其结果见表1。

图2 松树蜂毒素样品裂解气相色谱质谱联用仪谱图

由图2、表1可见，松树蜂毒素中共检测出了42种物质，其中，离子丰度相对比较高的6种物质的保留时间分别为1.183、1.974、2.851、16.246、18.058、20.274 min，由气象质谱色谱试验得到每个保留时间对应峰的面积、基线高度、绝对高度、峰宽等数据，再查询NIST标准质谱谱图数据库，通过谱峰数据，检索相似谱图，得到丰度较高的每个峰对应的化合物的匹配项名称、质量、分子质量、CAS号等相关信息。

经整理和归类得知，松树蜂毒素主要由各种酸、酯、醇、烯、酮以及它们的同分异构体及顺反异构体组成，可归纳成生物碱、糖及糖苷、脂肪酸和蛋白质四大类，主要组成元素有碳、氢、氧、氮、硫、氟等，物质相对分子质量为80～500。脂肪酸包括棕榈酸、丁二酸、十四碳烯酸、十六碳烯酸、十八烷酸、十八碳烯酸、乙酸、油酸、辛酸等，大部分为碳原子较多的中链和长链脂肪酸，且多为含双键的不饱和脂肪酸，脂肪酸物质在毒素成分中占57.9%，含量最多，为组成松树蜂毒素的主要物质。糖及糖苷类物质在松树蜂毒素成分中占28.7%。松树蜂毒素中的糖类物质和脂肪酸类物质作为其主要的组成物质，占毒素成分的比例较大。

表1 松树峰毒素样品气相质谱色谱峰主要对应化合物

续(表1)

生物碱和蛋白质类物质虽然在毒素中含量较少，分别占5.1%和8.3%，但其作为具有生物活性的物质存在于毒素中，与松树蜂毒素对寄主树木的致病性有很大的关系。生物碱主要包含一些氮杂缩醛类、烯胺、亚胺及一些氮氧化物，蛋白质主要以多肽和酶的形式存在，包括磷脂酶、蛋白酶、肽酶、酯酶等水解酶，催化底物结构的异构化反应的顺反异构酶，以及一些常见的氧化还原酶。

3 结论与讨论

与其他组织和器官相比，松树蜂的毒素囊占据了雌虫腹部相当大的空间，以便于松树蜂贮存尽量多的毒素，其贮菌囊、毒素囊和卵巢形成的“三通管”的结构充分体现了其结构与功能的高度统一性。据文献报道，寄生性膜翅目昆虫的泌毒器官起源于外胚层，由生殖系统的附腺演化而来，其毒液由成熟雌蜂的毒腺或酸腺所分泌，并贮于毒囊中[13]。因此，松树蜂雌成虫毒素腺与输卵管相连的结构可以说明松树蜂的毒素腺和毒素囊符合进化演变的规律，和蜜蜂等蜂毒素在体内的分泌和贮藏器官发育来源一致。

研究表明，中华蜜蜂(Apisceranacerana)分泌的报警信息素中主要成分是乙酸异戊酯和乙酸苄酯，还包括乙酸正丁酯、乙酸正已酯、乙酸正辛酯、乙酸正癸酯、乙酸苯酯、乙酸二十酯、辛酸等20余种成份，同时，有关寄生性膜翅目昆虫毒素的研究中指出已知膜翅目昆虫毒素中含有烃类、醇类、醛类、酮类、羧酸类、酯类、内酯类、酶类等多种化合物[13-14]。因此，松树蜂毒素中含脂肪酸这一现象基本符合膜翅目昆虫毒素的演化规律。

漆酶是多酚氧化酶中最重要的一种酶，本课题组前期高成龙通过对松树蜂毒腺进行转录组分析，筛选出11条漆酶基因[15]，同时，李大鹏等[5]通过以ABTS为底物测定的方法检测到了松树蜂毒素内漆酶的存在[5]，由此可以得出松树蜂毒素成分中包含漆酶这一结论。李大鹏等[5]在研究中证实了松树蜂毒素能够显著地促进共生真菌A.areolatum漆酶的分泌并提高其漆酶活力，这与松树蜂毒素中包含漆酶这一结论相符，并进一步证明了松树蜂的共生菌和毒素在危害寄主树木时存在的协同关系。

李玉梅等在对蜜蜂毒素的研究中指出，蜜蜂毒中含有蜂毒素、蜂毒神经肽、磷脂酶、透明质酸酶、组织胺、碳水化合物等多种复杂成分，且具有很高的生物活性[16]，与本研究中对毒素蛋白质的研究结果基本一致。由于酶的生物活性极高，可猜测在松树蜂毒素中蛋白质可能是对寄主树木造成伤害的主要活性物质。早期的研究学者指出松树蜂毒素是一种由黏多糖和蛋白质等物质组成的呈酸性的混合物，含有多种酶、活性多肽和其他小分子量物质[17]，有研究者利用化学成分分离技术结合生理试验，证实毒素混合物中的一种具有生物活性的多肽是引起寄主受害症状出现的关键因子，接种该活性多肽的供试枝条出现了萎蔫、失绿变黄等典型症状[8]，也说明松树蜂毒素中主要的活性物质为蛋白质。

生物碱是一类含氮的碱性有机化合物，有显著的生物活性，一般以盐类、苷类、酰胺类、N-氧化物等形式存在于自然界植物或动物中，研究发现某种在植物中广泛存在的吡咯里西啶类生物碱，以及山豆根(Euchrestajaponica)中的苦参碱和氧化苦参碱等多种生物碱对生物机体均具有明确的毒性作用[18-20]。但目前为止对昆虫尤其是膜翅目昆虫体内含有的生物碱的文献和相关报导还较少，且松树蜂毒素中的生物碱含量相对来说最少，对于它是否是导致寄主松树出现针叶枯黄、萎蔫等现象的原因，以及它的致病机制还需要进一步的深入研究。

刘岭等[21]选用单一流动相，采用不同规格的Sephadex凝胶柱分3步对蜂毒素进行分离提纯，洗脱速度适中，纯化过程较省时，经高效液相色谱法进行含量测定，证实分离所得的蜂毒素具较高的纯度。徐彭等[22]利用蜂毒肽(蜂毒素)的油水两亲性和其分子结构中不含巯基及双巯键，对蜂毒素进行溶酶萃取和化学裂解处理，同时利用其在浓度高时常以四聚体形式存在的特性，采用在含4 mol·L-1脲(使蜂毒肽的四聚体解散)与不含4 mol·L-1脲的2种不同情况的缓冲液系统中，进行凝胶过滤柱层析，所获产品的纯度和得率均较高。本研究中，松树蜂毒素由于直接从解剖的毒素囊中获得，杂质较少，纯度较高，该方法可为松树蜂毒素中蛋白质中多肽和氨基酸等活性物质的分离提纯提供思路，也可从松树蜂基因表达量和毒素腺转录组分析等分子生物学方面进一步探讨多肽的作用机制，为接下来对毒素的研究打下基础。相比于其他成分检测方法，气相色谱质谱联用法具有进样量少、灵敏度高、分离性好、分析速度快、检出限低等优点，但操作比较复杂。为提高试验过程的操作性和安全性，可以从样品的预处理、干扰杂质的排除、色谱柱类型的选择以及升温程序的优化等方面对检测方法加以改善，以助于试验更顺利的进行。