一种瑶浴散剂质量标准的试验研究

李金洲，陈子隽，刘玟君，卢惠敏，林玉港，魏江存，陈 勇

（1.广西中医药大学药学院，南宁 530022；2.广西中医药大学科学实验中心，南宁 530022；3.广西国际壮医医院壮瑶药研发中心，南宁 530022）

瑶族人民生活在山高林密、气候湿热的崇山峻岭之中，这里常年高温多雨，毒虫遍地，瘟瘴盛行［1］。在长期的生活实践中，瑶族人民总结出了一套集养生、保健、祛病于一体的瑶族医药文化，瑶浴就是瑶族医药的杰出代表之一。瑶浴具有祛风除湿、活血化瘀、排汗解毒等功效。由于瑶浴的独特功效，其与芬兰的桑拿浴、土耳其的蒸汽浴共同被誉为世界上优秀的三大沐浴文化。2008 年6 月，瑶浴被列入第二批国家非物质文化保护遗产名录［2］。目前市面上瑶浴产品琳琅满目，瑶浴养生馆的数目也在逐年增多，可见瑶浴这种养生方式越来越受到人们的青睐。

但是，尚缺乏标准对瑶浴产品进行相关的质量控制，对于单个瑶浴产品的质量控制研究也比较少见。目前国内对瑶浴及瑶浴产品质量标准的研究还十分欠缺，瑶浴的保护与传承还有很多工作要做［3］。为发扬、推广瑶浴的使用，保障其使用安全，本试验研究了取自瑶族聚居地——广西壮族自治区金秀瑶族自治县的一种民间常用瑶浴粉，该瑶浴粉具有安神助眠的作用，在当地具有较高的知名度，其主要以合欢皮、石菖蒲、鸡血藤、茯神、三七叶、樟树、刺五加、柚子叶、玫瑰花等产自广西金秀圣塘山的天然药材组成。试验观察瑶药粉末显微性状和显微鉴别特征，并对其进行薄层鉴别检查；按2015 版《中华人民共和国药典》（四部）通则中的方法对药粉进行水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量进行测定［4］；采用HPLC 法测定药粉中β-细辛醚的含量。以期对该瑶浴粉进行质量控制，并为其他瑶浴产品的质量控制提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

圣塘山瑶浴粉（生产批号180312、180414、180512、180616、180712、180812、180912、181014、181016、181116），β-细辛醚对照品（生产批号RQA579，纯度≥98%，毕得医药）；合欢皮阴性对照样品（自制），鸡血藤阴性对照样品（自制），石菖蒲阴性对照样品（自制），合欢皮（20190601）、鸡血藤（20190501）、石菖蒲（20190501）对照药材均购自广西仙茱中药有限公司，并经广西中医药大学药用植物学教研室郭敏副教授鉴定，确定为豆科植物合欢（Albizia julibrissinDurazz.）的干燥树皮、豆科植物密花豆（Spatholobus suberectusDunn）的干燥藤茎、天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）的干燥根茎。

Waters e2695 高效液相色谱仪，PhenomenexC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；徕卡DM2500 光学生物显微镜、DFC500 图像分析系统，德国莱卡仪器公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器；电热鼓风干燥箱、马弗炉，上海实验仪器厂有限公司；SX2-4-10 电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；硅胶G 薄层板，青岛海洋化工厂。甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为纯净水。

1.2 方法

1.2.1 常规项目检查 水分测定按2015 版《中华人民共和国药典》［4］（四部）“0832 水分测定法”中的烘干法，浸出物测定按2015 版《中华人民共和国药典》（四部）“2201 浸出物测定法”热浸法，因考虑到瑶浴粉的使用方式，在浸出物测定法中只进行了热浸法，总灰分测定和酸不溶性灰分按2015 版《中华人民共和国药典》（四部）“2302 灰分测定法”。

1.2.2 制片方法 将瑶浴散剂粉碎后，过80 目筛，取适量，用水合氯醛溶液透化后稀甘油装片，将装片置显微镜下观察、测量、拍照。

1.2.3 色谱条件 Phenomenex C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，流动相甲醇-0.1%磷酸（65∶35），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长257 nm，进样量10 μL。

1.2.4 对照品溶液的制备 精密称取β-细辛醚对照品24.75 mg，用纯甲醇溶解并定容至50 mL 容量瓶中，制得约0.495 mg/mL β-细辛醚对照品溶液，微孔滤膜过滤，备用。

1.2.5 供试品溶液的制备 取瑶浴粉末0.50 g 置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞称定重量，浸泡1 h，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液即得［5］。

1.2.6 阴性对照溶液的制备 取缺石菖蒲样品0.50 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按照“1.2.5”方法制备阴性对照溶液。

2 结果与分析

2.1 常规项目检查

水分、浸出物、总灰分和酸不溶性灰分测定结果见表1。

2.2 显微鉴别

由图1 可知，粉末中有类圆形或长条形的石细胞，壁厚，孔沟明显，纤维成束，周围细胞含有草酸钙方晶，形成晶纤维，符合2015 版《中华人民共和国药典》中记载的合欢皮的典型显微特征。

图1 瑶浴散剂中合欢皮的显微特征

由图2 可见，粉末中具有明显的具缘纹孔导管，其中还含有黄棕色物质。红棕色块遍布视野，该特征符合2015 版《中华人民共和国药典》中记载的鸡血藤的显微特征。

图2 瑶浴粉中鸡血藤的显微特征

由图3 可知，粉末中可见多角形草酸钙方晶、类圆形分泌细胞，细胞内充满着红棕色分泌物，该特征符合2015 版《中华人民共和国药典》中记载的石菖蒲的典型显微特征。

图3 瑶浴粉中石菖蒲的显微特征

2.3 TLC 定性鉴别

2.3.1 瑶浴粉与合欢皮薄层鉴别 取瑶浴粉2.0 g，加入50%甲醇40 mL，浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 mL 溶解，用正丁醇振摇提取2 次，每次5 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL溶解，得到试品溶液。取合欢皮对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液；另取缺合欢皮阴性样品，同法制成阴性对照溶液。按照2015 年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502 进行试验，分别吸取上述3 种溶液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%三氯化铝溶液加热显色，置于紫外灯（365 nm）下检视（图4）。由图4 可知，供试品色谱在与对照药材相应位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照处无斑点干扰。

图4 合欢皮TLC 色谱

2.3.2 瑶浴散剂与鸡血藤薄层鉴别 取瑶浴粉2.0 g，加入20 mL 乙醇超声提取30 min，过滤，滤液蒸干，加5 mL 水溶解，用5 mL 乙酸乙酯萃取2 次，挥干乙酸乙酯，残渣加甲醇溶解，得到供试品溶液。取鸡血藤对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液；另取缺鸡血藤阴性样品2.0 g，同法制成阴性对照溶液。按照2015 年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502 进行试验，分别吸取上述3 种溶液各 2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（30∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（254 nm）下检视（图5）。由图5 可知，供试品色谱在与对照药材相应位置上显相同颜色的荧光斑点，可见阴性对照无斑点干扰。

图5 鸡血藤TLC 色谱

2.4 系统适用性试验

取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“1.2.3”色谱条件进样测定，记录色谱（图6）。由图6 可知，理论塔板数按β-细辛醚峰计不低于3 000，分离度均大于1.5，其他成分对测定无干扰。

图6 高效液相色谱

2.4.1 线性关系考察 取对照品溶液 1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为 49.5、99.0、148.5、198.0、247.5 μg/mL 的标准溶液，取适量进样测定，记录色谱图。以β-细辛醚质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得β-细辛醚的回归方程为Y=4.73×104X-7.85×105，（n=5，R=0.999 9），结果表明，β-细辛醚在质量浓度为 49.5～247.5 μg/mL 呈现良好的线性关系（图7）。

图7 β-细辛醚标准曲线

2.4.2 定量限与检测限考察 取对照品溶液适量，倍比稀释，进样量为10 μL，以信噪比10∶1、3∶1 分别测定定量限、检测限。结果表明，β-细辛醚的定量限为0.92 ng，检测限为0.31 ng。

2.4.3 精密度试验 取对照品溶液适量，按色谱条件重复进样测定6 次，每次10 μL，记录β-细辛醚的峰面积并计算RSD值。结果表明，β-细辛醚峰面积的RSD为0.26%，说明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取供试品溶液（批号180312）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、10、12 h，然后按色谱条件进样测定，记录峰面积。结果表明，β-细辛醚峰面积的RSD为0.98%，说明供试品溶液于室温下放置12 h 内基本稳定。

2.4.5 重复性试验 取瑶浴散剂样品适量（批号180312），按色谱条件进样测定，记录峰面积并按回归方程计算样品中β-细辛醚的含量。结果表明，β-细辛醚的平均含量为0.073 2%，RSD为0.98%（n=6），说明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的瑶浴散剂样品（180312）适量，共6 份，精密称定，分别加入一定量的β-细辛醚对照品，制备供试品溶液，再按色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.4.7 耐用性试验 精密称取瑶浴散剂样品（180312）适量，制备供试品溶液，再按色谱条件进样测定，考察不同色谱柱（Thermo Acclaim120 C18、Fei⁃niGen RedClassicalⅡ C18、Phenomenex Gemini C18），流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）、柱温（25、30、35 ℃）对样品含量测定结果的影响，结果见表3。结果表明，当色谱柱、流速和柱温发生一定程度变化时，能满足测试要求，方法耐用性良好。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

表3 耐用性试验结果

2.5 样品含量测定

取10 批瑶浴散剂样品各适量，制备供试品溶液，再按色谱条件进样测定，记录峰面积并按回归方程计算样品含量，结果见表4。由表4 可知，不同批次的瑶浴粉中β-细辛醚含量在0.071%～0.085%，各批次大致相同，且RSD符合2015 版《中华人民共和国药典》中的要求。故建议以不低于均值80%设限，即该瑶浴粉中β-细辛醚含量不得低于0.064%。

表4 样品含量测定结果

3 讨论

石菖蒲具有镇静、抗癫痫、抗抑郁、抗疲劳、抗氧化等药理作用，与本瑶浴粉的主要功效一致，故选用石菖蒲中主要化学成分作为含量测定的指标成分［6，7］。石菖蒲中 α-细辛醚和 β-细辛醚是 2 种主要的挥发油成分，故在试验过程中对石菖蒲中的α-细辛醚进行了含量测定，与β-细辛醚相比含量更低，因此最后选用β-细辛醚作为瑶浴粉中的指标成分［8］。合欢皮具有解郁安神的功效，用于心神不安。查阅2015 版《中国药典》（一部）发现，合欢皮含量测定的指标性成分（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，但在试验中发现，该成分在瑶浴粉中含量太低，难以检测［9］。鸡血藤是一味具有补血活血、舒筋活络的药材，该作用与瑶浴粉的保健养生功效基本一致，故选择鸡血藤和合欢皮进行薄层色谱鉴别。在进行薄层色谱鉴别时，按照2015 版《中华人民共和国药典》（一部）中合欢皮和鸡血藤的薄层展开条件进行展开，发现并不能取得较好的展开效果，只能重新对薄层展开条件进行摸索。查阅文献，发现樟木［10］、三七叶［11］、柚子叶［12］、玫瑰花［13］中均含有黄酮类化合物，且结构相似，阴性干扰严重。故最后确定选用鸡血藤和合欢皮进行薄层定性，且这两味药也是瑶浴散剂中的主要成分，符合中药复方质量控制的相关规定［14］。

试验初步建立了广西壮族自治区金秀瑶族自治县瑶族人民常用的一种瑶浴散剂的质量标准，还有许多需要完善的地方，有待进一步的试验研究。希望通过该试验能给瑶浴产品的质量控制研究提供一定的参考依据和研究思路，建立瑶浴产品的初步质量标准来对市面上常见的瑶浴产品进行控制，确保瑶浴产品的安全性、有效性和可控性。