多糖的化学修饰及其结构鉴定研究进展

谢 苗，亓小妮，吴杨洋，张 鑫，杜秀菊

（聊城大学生命科学学院，山东 聊城 252059）

多糖是自然界中含量最多的一类高分子聚合物，具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节活性等生物活性［1］，是开发药品和功能性食品的重要原料。然而，来自于天然产物的一些多糖本身不具有生物活性或活性很低，或者是因为溶解性很低而影响其活性发挥。例如，茯苓多糖几乎不具有抗癌活性，但是经过羧甲基化等修饰后，在体内和体外都能表现出显著的抗肿瘤活性［2］，硫酸化后的牛樟菇多糖的抗肿瘤活性有显著提高［3］。

多糖及其衍生物的结构与生物活性有着非常密切的关系。多糖的化学修饰主要通过改变多糖的取代基种类、数目和位置、分子量、空间结构等从而影响其活性。研究表明，在多糖分子中引入合适的离子基团能够显著改善多糖的水溶性，通过改变多糖在水溶液中的构象提高其活性［4，5］。而且，不同的取代基团、取代位置和取代度（DS）对多糖衍生物的活性有着重要影响［6，7］。目前，多糖化学修饰的方法主要包括硫酸化、去硫酸化、磷酸化、乙酰化、去乙酰化、羧甲基化、硒化和降解等。

多糖衍生化前后的结构变化会在一些图谱如红外（Fourier transform infrared，FT-IR）图谱和核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）图谱上出现某些变化或产生一些特殊信号，通过比较修饰前后的图谱变化，可以反映多糖衍生化发生成功与否以及取代度高低，进而阐明衍生物的化学结构，再结合生物活性，有助于揭示和阐明多糖的构效关系。本研究根据最新文献资料，对多糖的化学修饰方法、衍生化多糖前后FT-IR 和NMR 图谱特征的变化进行了综述，以期对相关研究提供一些借鉴和参考。

1 多糖的化学修饰方法

多糖的主要化学修饰方法总结见表1，包括修饰类型、具体方法、所用试剂和生物活性等。

1.1 硫酸化修饰

硫酸化多糖参与很多生命过程，如生长分化、器官发生、病毒感染、血液凝聚和血管生成等［38］，在生命活动中起着非常重要的作用，因此，硫酸化修饰是多糖分子改性中非常重要的一个研究方向。研究表明，硫酸酯化多糖不仅增强原多糖的生物活性或产生新的药理作用活性，还能改善原多糖的水溶性［8-13］。多糖的硫酸酯化方法很多，目前常用的方法主要有三氧化硫法、氯磺酸法（Wolfrom）和浓硫酸法。

Zhang 等［8］采用三氧化硫法对乳杆菌多糖进行硫酸化修饰，具体过程如下：取植物乳杆菌多糖样品溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌均匀后加入适量三氧化硫吡啶化合物即得到衍生化多糖。张忠等［39］采用氯磺酸法制备硫酸化金耳多糖。用不同的亲核试剂溶解样品，60 ℃保温0.5 h，缓加氯磺酸反应3 h，冷却至室温，调节pH，透析，冷冻干燥获得硫酸化后的金耳多糖。结果表明，DMF 为最佳溶剂（DS 最高，为1.43），硫酸化金耳多糖的抗氧化能力及抑瘤活性与DS 成正相关。

三种修饰方法各有优劣。三氧化硫法的缺点为三氧化硫类药品价格昂贵，不利于大规模生产。浓硫酸法与氯磺酸法类似，均由浓硫酸提供硫酸基团，吡啶作为催化剂［40］。但多糖易被浓硫酸降解，所以浓硫酸法制备的多糖衍生化产品的得率和取代度往往最低。相比之下，氯磺酸法最优，目前广泛用于吡喃型多糖的硫酸化，该方法简单、有效，可在实验室中进行。

1.2 去硫酸化修饰

硫酸基是天然复杂多糖（如肝素、某些海藻多糖等）的重要修饰成分，硫酸化多糖是目前研究最为集中的一个多糖。为了探讨硫酸基团DS 和取代位置与多糖之间的构效关系，去硫酸化修饰是化学修饰研究的一个方向。目前有碱水解、酸水解和甲醇解3 种方法。其中，碱水解法硫酸基的去除率较低，酸水解法中硫酸基的去除率虽然较高，但在酸性条件下S-O 容易发生断裂，采用甲醇解糖苷键则不受影响［38］。Xu 等［14］通过甲醇解的方法制得脱硫硫酸化的卡拉胶寡糖。具体操作方法为：将酶解后的卡拉胶寡糖溶于含有DMSO、10%的甲醇和1%的吡啶的混合溶液中，将混合物置于100 ℃反应4 h，用蒸馏水透析至少3 d，醇沉，浓缩，冷冻干燥即得脱硫卡拉胶寡糖。

1.3 磷酸化修饰

研究表明，磷酸酯化多糖水溶性明显增强，具有抗氧化、抗肿瘤和抗衰老的活性［15-19］。常用的方法有磷酰氯法、磷酸盐法和磷酸法 3 种。Chen 等［16］利用磷酰氯法制备了取代度不同的磷酸化多糖。制备过程如下：将磷酰氯试剂滴入无水吡啶中制备磷酸化试剂，多糖样品溶于DMF，倒入含有磷酸化试剂的三颈烧瓶反应得磷酸化南瓜多糖。相比于其前体物，磷酸化多糖具有较强的抗氧化活性。在磷酸盐法中，三聚磷酸钠和三偏磷酸钠常常被混合使用，Zhang 等［18］采用磷酸盐法成功制备了磷酸基的含量为14.36%的磷酸化瓜蒌皮多糖。药理活性结果表明，修饰后的瓜蒌皮多糖（磷酸基的含量为14.36%）比其前体物抗衰老能力显著增强。

1.4 乙酰化修饰

有研究表明，乙酰基的引入能改变多糖分子的定向性和横向次序，最终导致多糖羟基基团暴露，改变其物理性质，增加其在水中的溶解性，因此对其生物活性产生影响［41］。例如，对壳聚糖分子内活泼的氨基和羟基基团进行乙酰化修饰，能改善其溶解性，赋予壳聚糖更多的特殊功效［42］。斜顶菌多糖乙酰化修饰后，其抑瘤活性较修饰前有明显提高，其原因除修饰基团自身因素外，还与修饰后水溶性改变有关［43］。梁进等［44］对茶多糖进行乙酰化修饰，发现乙酰化多糖能提高抗凝血活性。因此，利用乙酰化修饰进行分子改性是改善多糖理化性质、提高其药理功能的一个重要途径。

目前乙酰化修饰中，乙酸酐是最普遍适用的乙酰化试剂，主要有乙酸酐法、吡啶-乙酸酐法和DMF-乙酸酐法 3 种方法。Yang 等［21］在恒温下滴加适量乙酸酐于pH 为9 羊肚菌多糖溶液，获得乙酰化羊肚菌多糖（DS 最高为 0.4）。周林等［23］采用吡啶-乙酸酐反应体系，将裂褶多糖溶于DMSO，加入120μL 吡啶和不同体积的乙酸酐，透析液经干燥获得乙酰化产物，经乙酰化修饰后的多糖分子量明显降低。Liu 等［25］以 DMF 为溶剂将适量样品溶解，无水乙酸酐缓慢滴入，反应10 h 后收集含有样品溶液醇沉干燥即得乙酰化白芨多糖，在此条件下多糖的DS 为0.80。结果表明，DMF-乙酸酐法方便，易于控制产物的DS，修饰产物的水溶性明显提高。

表1 多糖化学修饰方法汇总

1.5 去乙酰化修饰

去乙酰化修饰有助于挖掘多糖衍生物潜在的生物活性，研究乙酰基团的DS 和取代位置与其活性之间的构效关系。目前去乙酰化修饰的方法有NH2NH2-HIO3法和压缩法。Zhang 等［26］为了探讨硫酸软骨素的去乙酰化产物的潜在生物活性，采用NH2NH2-HIO3法制备了去乙酰化硫酸软骨素。将样品软骨硫酸钠溶于含1%硫酸肼的无水肼溶液中，105 ℃密封孵育10 h，乙醇沉淀，复溶于5%醋酸溶液中，再添加0.5 mol HIO3，置于4 ℃冰箱2 h，乙醚反复萃取，NaOH 中和水相，然后醇沉，透析，冷冻干燥成功获得目标产物。而He 等［27］采用压缩法也成功对壳聚糖进行了去乙酰化修饰。将壳聚糖和适量NaOH 混合均匀后加蒸馏水稀释至碱溶液浓度始终保持在5%～15%，反应容器置于高压蒸气灭菌锅中反应，醇沉干燥获得去乙酰化的程度高达95%乙酰化壳聚糖。此法借助了高温，因此便捷且无污染。

1.6 羧甲基化修饰

茯苓是传统中药的“四君八珍”之一，具有广泛的药理活性，然而占茯苓高达93%的茯苓聚糖却几乎无抗肿瘤的作用，但如将其进行羧甲基化修饰后，不仅提高了水溶性，还具有很强的抗肿瘤活性［45］。羧甲基化修饰也是改善多糖生物活性非常重要的一个途径。

目前羧甲基化修饰方法主要有水媒法和溶媒法两种。水媒法是指多糖样品溶于稀碱溶液，再加入卤代酸试剂，而溶媒法则是指先将多糖溶于有机溶剂，再加入碱液碱化，最后加入卤代酸于适宜条件反应。Wang 等［29］采用水媒法将青钱柳多糖溶于20%NaOH 溶液搅拌后静置1 h，加入无水乙醇和一氯乙酸反应，透析液冷冻干燥即得羧甲基化多糖。

由于水媒法副反应较多，加入酸性试剂会产生黏稠物质，不易分离，故多糖羧甲基化时倾向于溶媒法。目前相比于水媒法，溶媒法被广泛应用。Li等［46］采用溶媒法制备了羧甲基化羊肚菌多糖。将羊肚菌多糖置于含有20%NaOH 溶液的异丙醇溶液中，冰浴中搅拌反应3 h，室温条件下缓慢滴加氯乙酸，透析，冷冻干燥即得羧甲基化羊肚菌多糖，研究表明羧甲基化多糖比其前体物具有较高的抗炎活性。

1.7 硒化修饰

有研究表明，硒化多糖的生物活性普遍高于多糖和无机硒且易被机体吸收和利用［47］。因此多糖的硒化修饰具有非常重要的理论意义和实践价值。目前硒化方法主要有H2SeO3-HNO3-BaCl2法和亚硒酸钠-稀硝酸法。Wang 等［33］运用 H2SeO3-HNO3-Ba⁃Cl2法将亚侧耳多糖样品溶于0.8%硝酸溶液，然后将适量亚硒酸与1 mol/L BaCl2溶液混合加入，以制得硒化亚侧耳多糖 Se-HSP。Xiao 等［34］根据亚硒酸钠-稀硝酸法制备硒化海藻多糖。

1.8 降解修饰

据报道，在一定分子量范围内，一般多糖分子量越小，其表现的生物活性越强［48］，推测原因可能是因为小分子量的多糖可以自由穿梭生物膜。目前对于多糖的降解方法主要有H2O2-维生素C 法、Fe2+-H2O2法和超声降解等。H2O2-维生素C 法、Fe2+-H2O2法是最常用的方法，这2 种方法都是将多糖样品加水溶解，只是加入的催化剂不同，前者是加入等摩尔的H2O2和维生素C，后者是加入1%FeSO4和H2O2溶液，反应液在室温条件下反应2 h，透析后即得目标降解多糖。H2O2-维生素C 法获得的枸杞叶多糖降解后在水溶液中由先前的球形结构变为杂乱的环状［35］，降解后抗血小板活性也随之提高，Fe2+-H2O2法制备的降解后的黑加仑多糖主要结构没有变化［36］，且多糖分子量越小，其生物活性越强，超声降解后的多糖的抗氧化活性虽略有提升，但其三螺旋结构遭到了破坏［37］。

2 多糖衍生物结构鉴定

2.1 红外图谱

红外光谱在取代多糖的定性和定量分析中发挥着非常重要的作用，而且方便快捷，因此多糖的衍生化成功与否以及衍生化程度往往首先通过FT-IR 图谱检测。多糖经不同方法改性后的多糖衍生物的红外特征峰归纳见表2。

多糖经硫酸化或去硫酸化后S=O、S-O 和C-OS 伸缩振动峰会发生相应变化，硫酸酯化后的黑木耳多糖在1 235 cm-1新出现了不对称的S=O 伸缩振动峰［10］，在819 cm-1出现了对称的 C-O-S 振动峰；同样，仙人草多糖在硫酸酯化后［12］在1 260 cm-1出现了不对称的S-O 伸缩振动峰，在814 cm-1出现了C-OS 伸缩振动峰。多糖经乙酰化或去乙酰化后会，出现新的或减少C=O 伸缩振动峰和羧基伸缩振动峰。青钱柳叶多糖经乙酰化修饰后，在1 240 cm-1的吸收峰随着乙酰基取代度的增加而增加［50］。金耳多糖去乙酰化后，与天然多糖TAPA1 相比，在1 733.7 cm-1和 1 249.7 cm-1的吸收峰消失［24］，表明乙酰基团被完全去除。硒化的海藻多糖在675 cm-1出现了不对称的 Se-O-C 的伸缩振动吸收峰［34］。

2.2 核磁共振图谱

分子改性后的取代基在NMR 上会出现特有的信号峰，因此可以通过NMR 图谱信息变化来验证多糖衍生化成功与否。Chen 等［52］通过比较硫酸化黄瓜多糖与其前体物（黄瓜多糖）的NMR 图谱结果，13C NMR 图谱中 δ 109～110 ppm 出现了新的共振峰，印证了硫酸化的成功发生。多糖磷酸化改性后，可以很容易地通过31P NMR 新出现的信号峰得到证实［53］。Chen 等［17］通过31P NMR 上在 δ-30-5 ppm 新出现的3 个信号峰印证了磷酸化成功发生，结合13C NMR上C2，C3，C5的化学位移的变化，最终确认了有3个磷酸化位点。瓜蒌皮多糖磷酸化后在31P NMR 图谱中，在δ 0.95～1.73 ppm 区域出现了较强的且较多的磷共振吸收峰，表明瓜蒌皮多糖磷酸化成功发生［18］。乙酰化修饰是否成功发生，可以通过下列信息进行确认。乙酰基中甲基碳的信号在δ 20～22 ppm，甲基氢的信号在δ 1.8～2.2 ppm，乙酰基的羰基信号在δ 170～180 ppm，与此同时，在HMBC上会有甲基氢和羰基的共振信号出现［54］。Du等［24］从金耳多糖分离的一种天然酸性多糖TAPT1含有0.7%的乙酰基（DS为0.03）。为进一步提高其活性，对TAPT1 分别进行乙酰化（TAPT1-ac）和去乙酰化（TAPT1-de）等化学修饰，TAPT1-ac 和 TAPT1-de 的 DS 分别为 0.23和 0。TAPT1 中因为有乙酰基的存在，在1H NMR δ 2.02 ppm 处 和13C NMR δ 23.79 ppm 处均有信号峰出现。乙酰化多糖TAPT1-ac在δ 2.02 ppm和δ 23.79 ppm 处的信号明显高于金耳多糖TAPT1，表明TAPT1 乙酰化成功发生；而在去乙酰化产物TAPT1-de 的NMR中，δ 2.02 ppm 和δ 23.79 ppm 处的信号完全消失，表明去乙酰化成功发生。Chen 等［55］采用水媒法制备了羧甲基苦瓜多糖，与其前体物相比，羧甲基化多糖在13C NMR δ 70 ppm 处的信号明显增强，表明羧甲基化改性成功。黑木耳多糖羧甲基化后在13C NMR δ 170～180 ppm处出现了新的信号峰，表明羰基存在，结合FT-IR 图谱结果证实了羧甲基化成功发生［30］。

表2 衍生化多糖红外特征吸收峰

基团的取代位置也是多糖结构的一个重要参数。多糖衍生化之后取代基团会影响13C NMR 和1H NMR 的化学位移，可以通过NMR 确定衍生化多糖中取代基团的位置。有研究发现，多糖硫酸化后直接与吸电子的硫酸盐基团相连的碳原子会向较低的磁场位置移动，而间接相连的碳原子则会向较高的磁场位置移动［56］，这个规律被称为苷化位移规则，即糖上的羟基被其他基团取代后，其相连羟基碳的化学位移将向低场移动［57］。而且，糖环上不同位置的碳原子发生取代后，不管是双糖、寡糖还是多糖，只要取代基相同，其向低场的化学位移数值基本一样［58］。被硫酸基取代后，被取代位置的碳的化学位移向低场移动6～9 ppm，通过比较硫酸酯多糖脱硫前后的13C NMR 谱（必要时，还要综合红外和化学实验结果），可以确定硫酸基在糖环上的取代位置［53，57］。 Liang 等［56］通过比较硫酸化前后多糖的13C NMR 图谱信号特征，确定了取代位置发生在C-2 和C-6 上［59］，其中 C-2 被硫酸化后 C-2 的化学位移由 63.7 ppm 向低场移动了3.3 ppm（为δ67.0 ppm），而且随着DS 的增加，取代硫酸基团的碳的电子环境变得复杂，信号的重叠越来越严重，所以仅从13C NMR 谱图确定取代位置还有很大的局限性。

3 展望

多糖的结构决定了其功能，其中取代基团的种类、取代位置和数量（以取代度或含量表示）都是多糖重要的结构参数，不仅影响其溶解度、分子量等理化性质和空间结构，更重要的是能改变多糖的生物活性。很多研究表明，改性后的多糖产品已经展现了广泛的药理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、增强免疫、抑菌等，特别是改性后的香菇多糖的抗病毒（HIV）活性在临床上已经成功应用。因此，多糖的化学修饰是多糖药物化学研究的一个重要分支，是提高天然多糖活性的一个重要途径。因此，多糖的化学修饰具有广阔的发展前景。

近几年，多糖的化学修饰虽有了广泛研究，但是尚显不足。①目前的分离纯化技术多糖制备效率不高，致使所得纯品量少不足以衍生化和结构分析，以后要加强分离纯化工艺技术和流程的研究，提高纯化效率，制备出更多的多糖纯品。②多糖化学修饰方法的针对性、有效性和可控性还不够高，应该加强化学修饰方法和工艺条件的筛选与优化，增加取代参数（如DS、取代位置）和分子量等方面的可控性。③目前多糖衍生化采用的先导化合物有些不是纯品，导致试验结果的重现性不好，衍生产品的取代位点和数量不稳定，以后应尽量采用均一多糖作为衍生化的试验对象，提高试验结果的稳定性和重现性。④目前工作主要集中在化学修饰方法的优化和药理活性的提高方面，改性后多糖的结构鉴定方面的研究报道不多，不利于分析和阐明多糖的构效关系。