微波消解/ICP-OES法对注射用氟氯西林钠中18种元素杂质的测定

张志峰，王子杏,2，李殿梅，严逸伦，殷 霞，范 军*，章伟光*

(1. 华南师范大学化学学院，广州 510006； 2. 广州研创生物技术发展有限公司，广州510663)

原料药、赋形剂、辅料、药品在生产和保存过程中与设备、储存容器等接触，可能将元素杂质带入药物中. 由于某些金属或非金属杂质表现出慢性毒理学风险，近年来对药品中元素杂质的含量提出了新的要求[1-2]. 为了保障原料药和制剂的质量，国际人用药物注册技术协调会议(ICH)制订了一系列关于药品质量控制的指南，其中ICH-Q3D元素杂质指南为口服、注射和吸入制剂中的24种元素杂质制订允许日暴露量(Permitted Daily Exposure，PDE)的标准.

目前，离子色谱法、原子吸收光谱法、火焰光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体光谱法(ICP-OES)等已被广泛应用于元素含量分析领域[3-5]. ICP-OES具有多元素同时分析、检出限低(达ppb级)、灵敏度高、动态线性范围宽、准确度和精密度良好、使用范围比电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)更广的优点. 2018年，MENOUTIS等[6]采用轴向ICP-OES对口服药物中17种低含量的元素杂质进行测定，使用超声雾化器配合水平观测模式代替ICP-MS. 2019年，PINHEIRO等[7]采用ICP-OES对液体药物样品的元素杂质进行分析，采用内标和单点标准加入法等校准策略有效地校正了基质效应；对卡马西平、盐酸阿米替林或乙酰水杨酸等难消解的药物，则提出采用微波诱导消解样品后进行分析检测的方法[8-9].

氟氯西林钠是一种半合成的耐青霉素酶的青霉素类抗生素，其结构与临床使用较多的氯唑西林、双氯西林、苯唑西林等类似，具有比青霉素更广的抗菌谱，主要用于治疗敏感的革兰阳性菌引起的皮肤及软组织感染、呼吸道感染及其他感染，亦是耐药菌产生的严重疾病的首选治疗药物[10].

注射用氟氯西林钠属于胃肠外给药，ICH-Q3D指南中对元素杂质含量有着严格要求. 目前尚未见注射用氟氯西林钠药物中元素杂质检测的报道. 在本研究中，参考美国药典USP<233>方法微波消解注射用氟氯西林钠样品，再采用ICP-OES建立了一种分析方法，用于检测铝、硼、钙、铁、锰、钾、镁、锌、钛、硅、砷、镉、铅、钴、钡、铬、锂和锑等18种元素杂质，优化了仪器参数，通过加标回收率确定其观测模式. 本方法的灵敏度和重复性好、准确度高、分析速度快，为注射用氟氯西林钠中元素杂质的检测和质量控制提供了参考.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

主要仪器：电感偶合等离子体发射光谱仪(ICAP7000，美国Thermofisher Scientific)、微波消解仪(Multiwave PRO，德国Anton Paar).

主要试剂：铝、硼、钙、铁、锰、钾、镁、锌、钛、硅、砷、镉、铅、钴、钡、铬、锂和锑等18种元素标准溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心，质量浓度均为1 000 mg/L；浓硝酸和双氧水(质量分数30%)为分析纯. 注射用氟氯西林钠(规格分别为0.25、0.5和1.0 g)的结构见图1. 实验用水为超纯水，通过超纯水仪(美国Millipore)制得.

图1 氟氯西林钠的分子结构

1.2 样品的微波消解

精密称取注射用氟氯西林钠样品(1.0 g)，置于消解罐中，加入浓硝酸(9 mL)在140 ℃下预消解15 min；再加入1 mL浓硝酸，冷却后，将其放入微波消解仪中，采用表1所列的消解程序进行消解. 待消解完成后，将装有消解样品的消解罐在120 ℃下加热浓缩以去除残余硝酸，最终将消解后的样品溶液浓缩至近1 mL. 将其转入100 mL容量瓶中定容，摇匀备用. 同时，进行空白实验，以消除可能的杂质污染[11-14].

表1 微波消解程序Table 1 The microwave digestion program

1.3 系列标准溶液的配制

1.3.1 Pb、Co、As和Cd混合标准溶液的配制 分别精密量取铅元素标准溶液400 μL、钴元素标准溶液400 μL、砷元素标准溶液1 200 μL和镉元素标准溶液160 μL，置于10 mL量瓶中，定容后摇匀，得到Pb、Co、As和Cd混合标准溶液，其质量浓度分别为 40、40、120和16 mg/L.

1.3.2 总混标溶液的配制 精密量取Pb、Co、As和Cd混合溶液250 μL，Al、B、Ca、Fe、Mn、K、Mg、Zn、Ti和Si等元素标准液各2 600 μL，钡标准溶液1 400 μL，铬标准溶液2 200 μL，锂标准溶液500 μL，锑标准溶液180 μL，混合在一支容积为50 mL的容量瓶中，定容后得到总混标溶液，其中，Pb、Cd、Co、As的质量浓度分别为0.20、0.08、0.20和0.60 mg/L，Al、B、Ca、Fe、Mn、K、Mg、Zn、Ti、Si的质量浓度均为52.00 mg/L，Ba、Cr、Li、Sb的质量浓度分别为28.00、44.00、10.00和3.60 mg/L.

1.3.3 标准曲线溶液的配制 精密量取上述总混标溶液0、0.50、1.25、2.50、3.75和5.00 mL分别置于容积为50 mL的容量瓶中，定容后得到各元素的标准曲线系列溶液.

1.3.4 系统适应性溶液的配制 精密量取总混标溶液1.25 mL置于50 mL量瓶中，定容得到系统适应性溶液.

1.3.5 检测限和定量限溶液的配制 以空白样品消解后的溶液连续进样11次，计算其标准偏差、检测限和定量限[6].

LOD=3×SD/k，

LOQ=10×SD/k，

其中，LOD和LOQ分别为各元素的定量限和检测限(mg/L)，SD为响应强度值的标准偏差，k为线性方程中的斜率，通过实验确定.

1.3.6 加标回收率溶液的配制 精密称取供试品9份，每份1.0 g，按照1.2所述方法进行消解，按限度质量浓度的80%、100%和120%分别加入1.3.2所述总混标溶液5.00、6.25和7.50 mL. 将其作为低、中、高浓度的加标供试品溶液，采用ICP-OES测定方法进行加样回收试验.

1.4 仪器的工作参数与测定方法

1.4.1 仪器的操作条件及参数 雾化器流量为0.50 L/min，等离子体流量为12.0 L/min，辅助气流量为0.5 L/min，蠕动泵转速为50 r/min，RF功率为1.15 kW，进样延时30 s，稳定时间为20 s，读数时间为5 s，重复读数次数为3次. 背景扣除：左右背景. 经优化后各元素的波长(nm)分别为：396.152(Al)、212.412(Si)、249.772(B)、189.042(As)、317.933(Ca)、226.502(Cd)、259.940(Fe)、220.353(Pb)、257.610(Mn)、228.616(Co)、766.490(K)、230.424(Ba)、279.553(Mg)、267.716(Cr)、213.856(Zn)、670.784(Li)、336.121(Ti)和206.833(Sb).

1.4.2 测定方法 采用外标法对各元素进行定量测定. 在上述电感耦合等离子体最佳条件下，分别对标准曲线、空白样品和待测样品进行分析，采用标准曲线进行定量.

2 结果与讨论

2.1 系统的适应性

将系统适应性溶液连续进样6针，结果见表2. 所测得元素质量浓度的RSD最大为5.89%，说明系统适应性良好.

表2 系统适应性及相对标准偏差(n=6)Table 2 The results of system adaptability and the RSDs(n=6)

2.2 ICP观测模式对元素加标回收率的影响

在ICP-OES研究中，水平观测模式具有灵敏度高和检测限低的优点而被优先采用. 首先采取水平观测模式测定18种元素的质量浓度，发现K和Li元素的加标回收率出现异常，其他元素的加标回收率结果在80%～110%之间. 因此，对比研究了水平观测模式和垂直观测模式对K和Li元素加标回收率的影响(表3). 采用垂直观测模式时，氟氯西林钠样品中K和Li元素的加标回收率均在103.2%～105.0%和98.6%～105.0%之间，RSD分别为1.08%和0.78%；采用水平观测模式时，K和Li元素的加标回收率在132.5～138.1%和75.1%～77.0%之间，RSD分别为2.07%和1.34%. 显然，采用水平观测模式时2种元素的加标回收率偏差远大于采用垂直观测模式，后者更适于K和Li元素的检测. 这是因为K和Li元素较易电离，等离子体尾焰对易电离元素有明显的干扰. 采用垂直观测模式时，光谱仪横向穿过等离子体[15]，虽然检测限略有降低，但显著降低了等离子体尾焰对易电离元素的干扰，显著改善了复杂有机样品基质下的电离效应.

表3 不同观测模式下K、Li元素的加标回收率结果及相对标准偏差(n=3)Table 3 The recovery results and RSDs (n=3) of K and Li elements under different observation modes

2.3 方法的线性、检出限和定量限

按各元素限度质量浓度的0～160%设计线性范围，考察线性关系、检测限和定量限等，结果见表4. 各元素标准曲线的线性相关系数(R2)在0.998以上，且各元素的LOD和LOQ结果能满足注射用氟氯西林钠药物中元素杂质的限度要求.

表4 线性相关系数、线性方程、检出限及定量限结果Table 4 The linear correlation coefficient, regression equation, LOD and LOQ

2.4 重复性、中间精密度及加标回收率

考虑到注射用氟氯西林钠样品中各元素杂质的质量浓度极低，采用在样品中加标方式进行重复性和中间精密度实验，加标量为100%限度质量浓度，结果见表5. 重复性和中间精密度的RSD分别小于4.05%和9.39%，符合USP<233>中重复性及中间精密度实验RSD小于25%的要求[16]. 在按限度质量浓度80%、100%和120%加标实验中，18种元素的加标回收率均在82.9%～105.7%之间，其RSD小于4.65%.

表5 平均加标回收率、重复性和中间精密度结果Table 5 The average recovery, repeatability and intermediate precision

续表5

2.5 ICP-OES检测氟氯西林钠样品中的元素杂质

采用微波消解和ICP-OES方法对某公司生产的规格分别为0.25、0.50和1.00 g、各3批次(标记为1、2和3)的注射用氟氯西林钠样品中进行元素杂质测定. 从说明书可知，注射用氟氯西林钠的每日最大用量为4.0 g. 氟氯西林钠药品中各元素杂质的限度质量浓度:LC=PDE/(mV)，其中，LC为某元素杂质的限度质量浓度(mg/L)，PDE为某元素杂质的每日允许暴露量(μg/d)，m为氟氯西林钠每日最大用量(g)，V为稀释体积(100 mL).

表6中的结果表明，在各规格不同批次的注射用氟氯西林钠产品中18种元素杂质的质量浓度存在差异，但均低于ICH-Q3D中对注射用药元素杂质的限度要求.

表6 注射用不同规格氟氯西林钠样品中各元素的质量浓度Table 6 The concentration distribution of 18 elemental impurities in flucloxacillin sodium for injection mg/L

3 结论

基于ICP-OES技术，按照USP标准要求，建立了一种注射用氟氯西林钠样品中18种元素杂质的检测方法，考察了观测模式对K和Li元素的加标回收率的影响. 结果表明：采用垂直观测模式可显著地降低电离效应对测定K和Li元素的影响. 本方法具有良好的线性、灵敏度、中间精密度和准确度. 对某企业提供的氟氯西林钠样品进行元素杂质的测定，各元素杂质的质量浓度符合国家药典制定的要求.