水稻粒形与千粒质量的QTL分析

李金吉，张银霞,2，赵 娜，田 蕾,2，杨淑琴,2，李培富,2

(1宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室，宁夏 银川 750021)

水稻(OryzasativaL.)是世界上三大粮食作物之一，超过50%的消费者以稻米为主食，因此培育优质高产水稻至关重要[1]。影响水稻产量的三大要素是有效穗数、穗粒数和千粒质量，其中千粒质量与粒形密切相关[2]。粒形不仅会影响水稻产量，而且也影响稻米外观品质[3-4]。其主要通过调控籽粒的粒长、粒宽、粒厚和千粒质量等性状影响水稻产量，而这些性状均是由多基因控制的数量性状(quantitative trait)[5]。所以在研究中需构建水稻遗传分离群体，通过遗传分析检测控制粒形性状的相关位点并构建遗传群体，将检测到的位点缩小到一定范围进行克隆。研究表明，采用的遗传群体和选择性状不同，会导致检测到的位点也不同[5-8]，但其目的均在于研究发现控制粒形性状的基因。近20多年来，陆续发现许多控制水稻粒形性状的QTL位点，并且部分基因已被克隆。Fan等[9]利用大粒亲本明恢63和小粒亲本Chuan7构建近等基因系，定位并克隆基因GS3，该基因与水稻粒长和千粒质量有关；Si等[10]检测并克隆控制水稻粒长和千粒质量的基因GLW7。Li等[11]用宽粒品种珍汕97和细长粒品种H94检测到与粒宽有关基因的GS5；Wang等[12]通过窄粒品种Basmati385和宽粒品种HJX74定位并克隆了控制水稻粒宽的基因GW8；Song等[13]通过构建群体进行遗传分析，最终克隆出影响粒宽的基因GW2；Shomura等[14]和Weng等[15]通过遗传群体Asominori/Nipponbare和IR24/Kasalath检测发现基因GW5/qSW5，其主要调控粒宽；Ishimaru等[16]用宽粒品种Nipponbare和细长粒品种Kasalath群体，检测到调控千粒质量的基因TGW6，其主要调控籽粒的灌浆机制。另外，林鸿宣等[17]检测到5个影响籽粒长度的QTL，4个控制籽粒宽度的QTL(其中主效基因和微效基因均为2个)，5个控制粒厚的QTL；赵芳明等[18]鉴定到3个影响千粒质量的QTL，2个影响粒长的QTL，2个影响长宽比的QTL；曹立勇等[19]鉴定到9个影响千粒质量的QTL。上述研究结果说明，采用不同的材料和群体所定位到的QTL位点不同。水稻育种中通过利用已克隆的与粒形相关的基因进行一些优良品种改良，提高了水稻的产量和品质，因此继续挖掘新的控制水稻粒形性状的基因，对于提高水稻产量具有重要意义。

本研究以大粒稻和东北小粒种(籽粒类似高粱粒，极小)为试验材料，分析籽粒的粒长、粒宽、千粒质量等性状的遗传规律，同时构建连锁遗传图谱并检测其QTL位点，旨在为水稻粒形基因及其调控提供资源，对提高水稻产量和改良稻米品质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料 水稻大粒品种大粒稻、小粒品种东北小粒种及其杂交F1，F1自交获得的F2群体材料，均由宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室提供。

1.1.2 仪器及试剂 主要仪器：PCR仪(生产于艾本德公司)，凝胶成像仪(生产于耶拿公司)，水平板电泳槽，电泳仪。

主要试剂：DNA提取液(50 mmol/L EDTA-Na2，pH 8.0；100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；500 mmol/L NaCl，体积分数1.25% SDS)、TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0；1 mmol/L EDTA-Na2，pH=8.0)、Tris Base、硼酸、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、琼脂糖、液体石蜡、 Gelview荧光染料、V氯仿∶V异戊醇=24∶1，均购自宁夏银川昕泰昌盛生物有限公司；6×loading buffer指示剂、Mixed SSR primer(4 pmol/L)、10×DNA Taq buffer、dNTP(2.5 mmol/L)、Taqenzyme(5 U/μL)， 均购自宁夏银川润研生物技术有限公司。

1.2 表型性状的遗传分析

试验材料于2018年4-5月种植在宁夏大学水稻育种基地，株距0.1 m，行距0.2 m，常规水肥管理。水稻植株成熟后，亲本、F1各随机取3株，F2群体随机取256个单株作为遗传群体。单株收获后自然晾干，用于表型测定。用游标卡尺测量粒长和粒宽，精确到0.01 mm，计算长宽比，每次测定的粒数均为10粒，重复3次，取平均值作为各性状表型值；每份材料取100粒，利用万分之一电子天平称量，重复3次，计算平均值，并折算成千粒质量。采用SPSS 23软件进行数据统计分析。

1.3 水稻粒形性状遗传连锁图谱的构建和QTL定位

1.3.1 DNA提取 在水稻分蘖盛期，采集亲本和F2群体的叶片，利用SDS法[20]提取叶片DNA。

1.3.2 遗传群体SSR分子标记检测 以总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板(10 ng/μL)2 μL，Mixed SSR primer(4 pmol/μL)1.5 μL，10×DNA Taq buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.4 μL，Taqenzyme(5 U/μL)0.4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s(退火温度视引物而定)，72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR特异性引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司北京分公司合成。

分子标记检测：采用3.6%琼脂糖凝胶或8%聚丙烯酰胺凝胶(19∶1)电泳检测SSR扩增产物。采用改进的银染法[21]检测聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

1.3.3 连锁图谱的构建和QTL定位 利用宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室保存的1 558对SSR标记，筛选亲本间多态性标记，然后用筛选出的多态性标记对F2群体进行分子检测。电泳检测结果与大粒稻带型相同的记为B，与东北小粒种带型相同的记为A，杂合带型记为H，缺失或不清的带型记为“-”，获得基因型数据。利用MapManagerQTXb20分析数据，划分可能的连锁群，检测粒形的QTL位点，计算各个位点的贡献率和加性效应，以P<0.01作为判断QTL存在的阈值。利用Mapchart 2.2软件绘制遗传连锁图谱。QTL命名原则遵循McCouch[22]的方法。

2 结果与分析

2.1 水稻亲本、F1及F2群体粒形性状的遗传分析

水稻亲本、F1、F2群体籽粒粒形性状平均值见表1。

表1 水稻亲本、F1、F2群体籽粒粒形性状平均值Table 1 Rice grain traits in F2,F1 and their parents

由表1可以看出，亲本大粒稻的粒长、粒宽、长宽比和千粒质量分别为8.74 mm、4.24 mm、2.06、38.98 g；双亲大粒稻与东北小粒种的粒长、粒宽、长宽比和千粒质量的差值分别为4.05 mm、1.04 mm、0.59、26.94 g。F1的粒长、粒宽、长宽比及千粒质量分别为7.66 mm、3.62 mm、2.12、30.03 g。F2群体各性状表型均值介于双亲之间，且均偏向亲本大粒稻。

从F2群体粒形性状频次分布图(图1)可知，F2群体中4个粒形性状均呈现连续变异的双峰分布，且粒长、长宽比和千粒质量均偏向于亲本大粒稻。这表明粒长、粒宽、长宽比及千粒质量均是由多个基因控制的数量性状，能够进行QTL定位分析。

图1 水稻F2群体粒形性状频次分布图Fig.1 Frequency distribution of grain shape traits for rice F2 population

2.2 水稻F2群体粒形性状的相关性分析

F2群体粒形性状相关性分析结果(表2)表明，千粒质量与粒长、粒宽、长宽比均呈极显著正相关，相关系数分别为0.815，0.491和0.701。说明控制粒长和粒宽的大小能够影响千粒质量，且粒长对千粒质量的影响更明显。

表2 水稻F2群体粒形性状间的相关性分析Table 2 Correlation coefficient of grain shape traits in rice F2 population

2.3 水稻F2群体遗传连锁图谱的构建和QTL定位

通过对1 558对SSR标记进行多态性筛选，共筛选出156对在亲本间具有多态性的SSR标记，占引物总数的10.16%。选择条带清晰、多态性明显的124对SSR标记进行F2群体遗传连锁图谱的构建，该连锁图谱覆盖水稻全基因组4 255 cM，标记间的平均距离为34.29 cM；其中每个标记间的最大遗传距离为50 cM，最小遗传距离为1.4 cM，覆盖水稻12对染色体(图2)。

图2 水稻F2群体的遗传连锁图谱Fig.2 Linkage genetic map of rice F2 population

通过对粒长、粒宽、长宽比和千粒质量进行QTL分析，结果见表3。由表3可以看出，本研究共检测到17个与粒形性状有关的QTL位点，分别位于水稻第2、3、4、5、9、10号染色体，单个QTL位点的贡献率为4%～18%。其中6个与粒长相关的QTLs分别位于水稻第2、4、5号染色体上，单个标记贡献率为4%～11%，以2号染色体上qGL-2-1的贡献率最大(11%)，其可能为控制粒长的主效QTL位点；qGL-2-1位点的加性效应为负值，其增效等位基因来源于大粒稻。3个与粒宽相关的QTLs(qGW-2-1、qGW-2-2、qGW-2-3)均位于水稻第2号染色体上，贡献率分别为6%，11%和12%，加性效应均为负值，其QTL位点的增效等位基因均来自于大粒稻；2个贡献率大于10%的位点为qGW-2-2和qGW-2-3，可能也属于主效QTL位点。5个与长宽比相关的QTLs分别位于水稻第2、3、5号染色体，即qL/W-2-1、qL/W-2-2、qL/W-3-1、qL/W-5-1、qL/W-5-2，其QTL位点贡献率分别为18%，5%，5%，4%和6%；其中qL/W-2-1位点的贡献率最大，可能为主效QTL位点。3个与千粒质量相关的QTL分别位于水稻第2、9、10号染色体上，贡献率分别为5%，4%和8%，加性效应分别为0.12，-0.52和1.63，其中2个QTL增效等位基因来源于东北小粒种，1个QTL增效等位基因来源于大粒稻。

表3 水稻F2群体粒形性状的QTL定位结果Table 3 QTL mapping of grain shape traits in rice F2 population

3 讨 论

3.1 水稻粒形性状的相关性

目前，提高水稻产量是科研工作者面临的一大挑战，而水稻产量与籽粒大小有着密切关系。粒形的粒长、粒宽、长宽比和千粒质量4个性状之间相互影响。梅德勇[23]研究发现,水稻粒长和粒宽均与千粒质量呈正相关关系。石春海等[24]研究表明，粒长与千粒质量呈显著正相关。吕勇[25]研究发现，水稻的千粒质量与粒长、粒宽、粒厚等均呈显著正相关。本研究通过对水稻F2群体内粒形性状间进行相关分析，发现粒长、粒宽和千粒质量3个性状两两间均呈极显著正相关，表明粒长和粒宽能够影响千粒质量，这与前人的研究结果存在一定相似性。

3.2 水稻粒形性状的QTL定位

水稻粒形是一个由多基因控制的数量性状，易受环境影响。目前已报道了600多个与粒形有关的QTLs，其中136个与粒长有关、139个与粒宽有关、74个与长宽比有关、220个与千粒质量有关[22]。随着水稻基因组测序和功能基因组学的发展，将有更多的粒形基因会被定位和克隆，对其调控机理研究也会越来越多。目前已克隆的基因对水稻粒形的表现具有重要的调节作用，相关基因调控水稻粒形的方式也很多，主要有转录因子调控、G蛋白途径以及通过调控激素水平控制粒形等[26]。

赵锦龙等[5]鉴定到15个与粒形性状有关的QTL，包括3个粒长QTL、4个粒宽QTL、3个长宽比QTL、5个千粒质量QTL，且有6个QTL位点与前人研究相同或相近，另外9个QTL可能为新位点。汪欲鹏等[27]检测到5个粒长QTL、9个粒宽QTL、8个粒厚QTL，且5个可能为影响粒形的新QTL位点。吕勇[25]共定位到33个与粒形有关的QTL，影响粒长、粒宽、粒厚、千粒质量的QTL个数分别为6，10，8和9，其中qGL3-3、qGW2-1、qGT2、qGT5已报道。张亚东等[28]利用2年的数据，共鉴定到25个影响粒形的QTL，新位点为qGW9、qGT2.2和qGT9。上述研究结果表明本试验研究的可行之处，挖掘控制粒形的新QTL能够对水稻粒形基因的研究有所帮助。

3.3 QTLs功能的可行性

本研究发现的QTL位点中，有些已经被报道或克隆，如检测到的位于第2号染色体RM1347、RM145、RM5699上的位点qGW-2-1、qGW-2-2和qGW-2-3与张亚东等[28]检测到位于RM1347-RM5699区间上的位点qGW2.2的区间相同或相近，且Song等[13]在相似的区域内克隆了粒宽基因GW2。Wu等[29]克隆出控制粒长的基因GL4，位于第4号染色体上RM3335-RM5608区间，与本研究检测到控制粒长的QTL位点不在同一区间，说明本研究检测到的4个QTL位点可能为新位点；Fan等[30]克隆的控制粒长和千粒质量的GS3、Weng等[15]克隆的控制粒宽和千粒质量的基因GW5与本研究所检测到qL/W-3-1、qGL-5-1、qL/W-5-1、qL/W-5-2是否为同一基因或等位基因，有待于进一步功能验证。qGL-2-1、qGL-4-1、qGL-4-2、qGL-4-3、qGL-4-4、qTGW-2-1、qTGW-9-1、qTGW-10-1等8个QTL位点在相应的区间尚未见报道，可能是新位点，后续试验将继续构建群体，对其进行验证和精细定位。说明利用大粒形和小粒形材料能定位到多个调控粒形的位点，这有助于研究粒形对水稻产量的影响。

4 结 论

本研究共检测到17个与粒形有关的QTLs，与粒长、粒宽、长宽比和千粒质量有关的QTL分别为6，3，5和3个，位于水稻第2、3、4、5、9、10号染色体上。贡献率大于5%的QTLs有8个。有多个QTLs被重复检测到，第2号染色体上RM5764附近的qGL-2-1和qTGW-2-1，分别控制粒长和千粒质量；第2号染色体上RM145、RM5699附近的qGW-2-2、qGW-2-3与qL/W-2-1、qL/W-2-2，前2个控制籽粒宽度，后2个控制籽粒长宽比；第5号染色体上RM3351附近的qGL-5-1与qL/W-5-2，分别控制粒长和长宽比，说明检测到的QTLs具有稳定性。试验中检测到可能为控制粒形的新位点，将会在下一步试验中进行验证，且对确定的新位点进行精细定位。