基于A型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

申水莹，闫若潜，雷从从，王淑娟，马震原，刘 影，赵雪丽，谢彩华，吴志明

(1 河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2 河南省动物疫病预防控制中心，河南 郑州450008；3 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；4 河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450002)

A型塞内卡病毒(SVA)可引起猪原发性水疱病，即塞内卡病毒病。SVA感染初期，病猪出现精神萎靡、进食困难、体温升高等症状，随后鼻、舌和蹄冠等部位出现水疱样病变，严重时会蔓延至蹄底部，使病猪出现跛行的症状[1]。母猪感染SVA后虽然死亡率极低，但其发病率可达90%，会造成产奶减少甚至停止、饿死乳猪等生产性能上的危害。1～3日龄新生仔猪感染SVA后体态瘦弱，贪睡，不愿进食，死亡率可达 30%～70%[2-3]，给养猪行业带来了巨大的潜在隐患。首例SVA毒株(SVV-001)于2002年由美国科研人员从细胞培养基污染物中发现并分离得到[4-5]；2002-2013年，SVA主要在美国和加拿大呈零星发生；2014-2016年，巴西、哥伦比亚和泰国均发现了猪SVA感染[6-9]。2015-2017年，塞内卡病毒病在我国广东、福建、辽宁、湖北、河南、黑龙江等地相继确诊[10-12]，目前国内尚无针对SVA的商品化疫苗，也无特效的治疗方法，一旦SVA大面积爆发必然给养殖产业带来极大的影响。

SVA为单股、正链、RNA病毒[13]，属塞内卡病毒属Senecavirus)，与心病毒属(Cardiovirus)成员的亲缘关系较近[4,14-15]。SVA基因组含有7 280个核苷酸，包括666个核苷酸的非编码区和一个包含6 543个核苷酸的开放阅读框。SVA有4种衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4[16]，其中VP1、VP2和VP3位于蛋白衣壳的外部，VP4位于蛋白衣壳的内部[17]，且VP1和VP3是主要的抗原表位区域，可刺激机体产生中和抗体[4,18]。Maggioli等[19]研究发现，在SVA感染的急性期，机体产生的抗体主要是抗VP2和VP3的特异性IgM；在康复期，机体产生的抗体主要是抗VP1、VP2、VP3 的特异性IgM和IgG[6]，说明VP3蛋白在感染早期就能产生中和抗体，可作为塞内卡病毒病早期检测的靶标抗体。

猪感染SVA的症状与口蹄疫、水泡性口炎和水疱性疹等水泡类疾病的症状十分相似，临床上难以区分[1]，国内对SVA的检测主要以RT-PCR为主，但ELISA方法既能达到与病毒中和试验、间接免疫荧光等方法高度一致，又可实现SVA的快速、简便、敏感的诊断要求，可用于大规模的流行病学研究或监测[20]。本课题组已建立了基于VP1蛋白的SVA间接ELISA检测方法[21]，本试验旨在进一步建立基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法，比较基于不同蛋白建立的SVA间接ELISA检测方法的差异，为SVA感染的临床诊断检测及未来疫苗免疫效果评价提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒与血清 SVA毒株及87份SVA阴性猪血清(采自健康猪，SVA荧光PCR检测阴性)、113份SVA阳性血清(采自SVA灭活疫苗免疫的猪，病毒中和试验检测阳性)和160份猪血清(20头SVA灭活疫苗免疫猪免疫后第14，21，28，35，42，49，56，63天的血清)，均由河南省动物疫病预防控制中心提供。O型和A型口蹄疫病毒 (FMDV)阳性血清，为兰州兽医研究所生产的阻断ELISA检测试剂盒中所配备。猪伪狂犬病毒(PRV) 、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清，均为美国爱德士(IDEXX)公司生产的ELISA检测试剂盒中所配备。

1.1.2 主要仪器和试剂 洗板机，瑞士Tecan Austria GmbH公司产品；BioTek-ELx808酶标仪，美国伯腾公司产品；蛋白超滤离心管，购于Millipore公司。病毒DNA/RNA提取试剂盒(CDC)，购于西安天隆科技有限公司；5×PrimeScript RT Master Mix、Agarose Gel DNA Extraction Kit、Plasmid Purification Kit，购于TaKaRa公司；BCA蛋白质量浓度测定试剂盒，购于碧云天生物技术公司；pGEM-T Easy Vector，购于Promega公司；JM109、BL21 (DE3)，购于康为世纪生物科技有限公司；pQE-30，购于优宝生物公司；T4连接酶、BamH Ⅰ和SacⅠ限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶，购于宝生物工程(大连)有限公司；10×PBST、TMB单组份显色液、Western Blot试剂盒，购于Solarbio公司；山羊抗猪HRP-IgG(H+L)，购于Proteintech公司；包涵体蛋白溶解及复性试剂盒，购于天恩泽生物科技公司。

1.2 SVA VP3基因的扩增及重组表达质粒的构建

参照GenBank中登录的SVAVP3基因序列(GenBank登录号为：MN885796)，设计1对特异性引物，P1：5′-TCAGGATCCCTGAACGCGAGAACCTCTAC-3′，下划线部分为插入的BamH Ⅰ酶切位点；P2：5′-TCAGAGCTCCAAGCCTATGTCCCAAATAGA-3′，下划线部分为插入的SacⅠ酶切位点。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，预期扩增出的目的片段长度为717 bp。

使用病毒DNA/RNA提取试剂盒(CDC)提取SVA的总RNA，用5×PrimeScript RT Master Mix将RNA反转录为cDNA，备用。以合成的cDNA为模板PCR扩增VP3基因，设以ddH2O代替模板的处理为阴性对照。PCR反应体系为：Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各0.5 μL，c-DNA模板3 μL。反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃停止。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后使用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段。

将VP3基因与pGEM-T Easy载体连接，构建重组质粒rT-VP3，进行蓝白斑试验筛选。对筛选出的阳性重组质粒进行PCR和测序鉴定，设以ddH2O代替模板的处理为阴性对照。将鉴定正确的重组质粒和pQE-30载体进行BamH Ⅰ和SacⅠ双酶切，回收两者的目的片段，用T4连接酶在4 ℃条件下过夜连接，构建重组表达质粒rpQE30-VP3。将rpQE30-VP3转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，对质粒进行PCR及BamH Ⅰ和SacⅠ双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

1.3 重组VP3(rVP3)蛋白的表达、纯化及抗原性鉴定

选取鉴定过的阳性菌落，1∶100接种到LB(含氨苄青霉素100 μg/mL)培养液，在37 ℃下180 r/min培养约2 h，测定600 nm处吸光值(OD600)为0.5～0.6时(即达到对数生长期)，加入IPTG使终浓度为0.3 mmol/L，诱导6 h。取1 mL菌液4 ℃下8 000 r/min离心5 min，取沉淀进行SDS-PAGE电泳，观察rVP3蛋白是否表达。将菌液于4 ℃下8 000 r/min离心30 min，收集菌体，于-80 ℃冻融后用裂解液重悬，超声波裂解(功率320 W，工作3 s间歇7 s，重复至菌体完全破碎)，4 ℃下8 000 r/min离心30 min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析rVP3蛋白是否可溶性表达。按照包涵体蛋白溶解及复性试剂盒说明书对包涵体溶解、洗涤及复性，之后用10 K蛋白超滤管5 000 r/min离心20 min进行浓缩，按照BCA蛋白质量浓度测定试剂盒说明书测定浓缩后蛋白的质量浓度。

采用Western Blot法鉴定rVP3蛋白的抗原特异性。将经过SDS-PAGE鉴定的样品重新进行SDS-PAGE，同时设置pQE-30转化的产物为阴性对照，然后电转印至硝酸纤维素膜(NC膜)。将NC膜置于封闭液(含50 g/L脱脂奶粉的PBST)中，4 ℃封闭过夜。将NC膜取出后用PBST洗膜3次，每次5 min；加入灭活的SVA阳性血清(1∶200稀释)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；加入山羊抗猪 HRP-IgG(H+L)(1∶5 000稀释)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；用ECL底物显色试剂盒显色。

1.4 间接ELISA方法工作条件的优化

采用矩阵法，分别对包被液[pH 7.2的PBS、pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CB)]、纯化的rVP3蛋白包被浓度(1，2，4 μg/mL)、封闭液(10 g/L BSA、50 g/L脱脂奶粉和5 g/L Casein)、封闭条件(37 ℃下2 h、4 ℃过夜)、样品稀释倍数(1∶25，1∶50，1∶100，1∶200)、TMB室温下作用时间(5，10，15 min)、山羊抗猪 HRP-IgG(H+L)稀释倍数(1∶2 500，1∶5 000，1∶7 500)和作用时间 (15，30，60 min)等条件进行优化。

1.5 间接ELISA方法临界值的确定

采用上述最优条件检测SVA阳性对照(经3次重复检测确定P值)和200份临床猪血清样品(87份SVA阴性猪血清和113份SVA阳性血清)。采用SPSS 16.0软件对200份血清样品在450 nm处的吸光值(OD450)进行分析。以敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，使用非参数构建受试者工作特征曲线(ROC)，以Youden指数(敏感性-(1-特异性))最大点作为阴阳性判断的临界点，确定间接ELISA方法的判定标准。

1.6 间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性检测

1.6.1 特异性 采用已建立的间接ELISA方法分别对SVA阴性血清、SVA阳性血清以及FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV阳性血清进行检测，同时设置SVA阳性对照，重复3次，分析该方法的特异性。

1.6.2 敏感性 随机选取SVA阳性血清10份，进行病毒中和试验；同时，对血清进行2倍倍比稀释(1∶2，1∶4，1∶8，…，1∶512)后，采用已建立的间接ELISA方法进行检测，分析该方法的敏感性。

1.6.3 重复性和稳定性 随机选取SVA阴性、阳性血清共10份。用3个批次rVP3蛋白包被的ELISA反应板进行检测；同时，采用同一批次rVP3蛋白包被的ELISA反应板，分别在3个不同的时间点进行检测。上述试验每份血清平行重复3次，测定OD450值。3次平行重复结果取其平均值，计算批内和批间的变异系数(CV)，分析该方法的重复性和稳定性。

1.7 血清样品的检测

分别采用本试验建立的方法和课题组已建立的基于VP1蛋白的SVA间接ELISA检测方法[21],对SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清进行检测，以SVA阴、阳性血清为对照，计算SVA抗体阳性率，分析两方法间的差异。

2 结果与分析

2.1 SVA VP3基因的扩增及rpQE30-VP3的构建

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在717 bp处获得一条特异性片段(图1-A)。筛选出的阳性重组质粒rT-VP3经PCR扩增，获得一条717 bp的特异性条带(图1-B)；测序结果证实，rT-VP3构建成功。构建的重组表达质粒rpQE30-VP3经PCR鉴定后，获得一条717 bp的特异性PCR扩增条带(图1-C)，BamH Ⅰ和SacⅠ双酶切鉴定获得了3 461和717 bp的条带，与预期结果相符(图1-D)。经测序对比分析,结果显示目的序列无碱基插入、突变或缺失，表明重组质粒rpQE30-VP3构建成功。

A.VP3基因PCR扩增结果；B.rT-VP3质粒PCR扩增结果；C.rpQE30-VP3质粒PCR扩增结果；D.rpQE30-VP3质粒双酶切鉴定结果。M.DNA Marker；1，3.阴性对照；2.VP3基因PCR扩增产物；4.rT-VP3质粒PCR扩增产物；5～6.rpQE30-VP3质粒PCR扩增产物；7～8.rpQE30-VP3质粒双酶切产物A.PCR amplification results of VP3;B.PCR amplification results of rT-VP3;C.PCR amplification results of rpQE30-VP3;D.Identification of rpQE30-VP3 plasmid digested.M.DNA Marker;1,3.Negative control;2.PCR amplification products of VP3;4.PCR amplification products of rT-VP3;5-6.PCR amplification products of rpQE30-VP3;7-8.Enzyme-digested product of rpQE30-VP3图1 SVA VP3基因及rT-VP3质粒和rpQE30-VP3质粒的鉴定结果Fig.1 Identification of SVA VP3 gene,rT-VP3 plasmid and rpQE30-VP3 plasmid

2.2 rVP3蛋白的表达、纯化及抗原性鉴定

rpQE30-VP3经IPTG诱导，表达出32 ku的rVP3蛋白(图2-A)。诱导表达产物经超声破碎后离心，取沉淀和上清进行SDS-PAGE鉴定，结果显示目的蛋白主要存在于沉淀中，表明rVP3以包涵体的形式表达。纯化的rVP3蛋白分子质量约32 ku(图2-B)。经Western Blot鉴定约32 ku处有特异性条带(图2-C)，表明rVP3蛋白能与SVA阳性血清发生特异性反应，具有较好的反应原性。经BCA试剂盒检测，该蛋白的质量浓度为1.54 mg/mL。

A.rVP3蛋白SDS-PAGE；B.rVP3蛋白纯化后SDS-PAGE；C.rVP3蛋白Western Blot。M.蛋白质标准分子量；1，6.pQE-30空载体诱导表达对照；2.未诱导的rVP3蛋白；3.IPTG诱导的rVP3蛋白；4，5，7.纯化后的rVP3蛋白A.The SDS-PAGE results of rVP3;B.The SDS-PAGE results of purified rVP3;C.The Western Blot of purified rVP3.M.Protein Marker；1,6.Induction of pQE-30 empty vector；2.Uninduction of rpQE-30-VP3；3.Induction of rpQE-30-VP3；4，5,7.Purification of rpQE-30-VP3图2 rVP3蛋白的表达、纯化及抗原性分析Fig.2 Expression,purification and antigenicity analysis of rVP3 protein

2.3 间接ELISA方法最佳工作条件的优化

矩阵法试验结果显示，间接ELISA的最佳工作条件为：抗原2 μg/mL，碳酸盐缓冲液(pH 9.6)在4 ℃下包被14～16 h，5 g/L Casein在4 ℃下封闭14～16 h，1∶100稀释样品在37 ℃下反应1 h，1∶5 000稀释山羊抗猪HRP-IgG(H+L)在37 ℃下反应30 min，TMB在室温避光条件下反应10 min。

2.4 间接ELISA方法的判定标准

利用SPSS 16.0软件对200份血清样品的OD450检测结果进行分析，绘制的ROC曲线见图3。结果显示，SPSS 16.0软件数据分析Youden指数最大时所对应的OD450值，即临界OD450为0.276，3次重复测定阳性对照的OD450为2.0。临界OD450/阳性对照OD450= 0.138，因此，本方法的判定标准定为：样本OD450(S)/阳性对照OD450(P)>0.138为SVA抗体阳性，反之则为阴性。

图3 基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法的ROC曲线Fig.3 ROC curve of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5 间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性

2.5.1 特异性 特异性检测结果(表1)显示，rVP3蛋白与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均为阴性(S/P≤0.138)，仅能与SVA阳性血清发生反应，表明本检测方法特异性较好。

表1 基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法的特异性Table 1 Specificity of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5.2 敏感性 敏感性检测结果(表2)显示，有6份血清样品的结果与中和试验一致，4份样品最高稀释度倍数比中和试验仅低1个稀释度。病毒中和试验能够检测出的平均最高稀释度为1∶150.4，而本方法能够检测出的平均最高稀释度为1∶113.6。结果表明，本研究建立的间接ELISA检测方法虽比中和试验结果略低，但依旧有较好的敏感性。

表2 基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法的敏感性Table 2 Sensitivity of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5.3 重复性和稳定性 将选取的10份猪血清分别进行批内和批间重复性检测，其变异系数(CV)分别为1.0%～3.8%和3.0%～8.0%，批内小于4%，批间小于9%(表3)，表明该检测方法重复性和稳定性较好。

表3 基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法的重复性Table 3 Repeatability of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.6 基于VP3，VP1蛋白的SVA间接ELISA法免疫血清检测结果比较

采用两种方法对SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清进行检测。结果显示，在免疫后的第14，21，28，35，42，49，56和63天，VP1抗体的阳性率分别为30.00%，70.00%，90.00%，100.00%，90.00%，90.00%，85.00%和80.00%；VP3抗体的阳性率分别为35.00%，70.00%，80.00%，100.00%，90.00%，100.00%，95.00%和95.00%(图4)，表明两种方法均能在不同时期检测出抗体，但抗体阳性检出率略有差异。

图4 基于VP3、VP1蛋白的SVA间接ELISA检测方法的检测结果对比Fig.4 Comparison of detection effects of indirect ELISA based on VP3 and VP1 protein

3 讨 论

2015年初，我国与SVA相关的水疱病暴发并开始增多，且与新生仔猪死亡率的升高密切相关[5,22]。2015年我国广东、福建、河南、湖北[23-24]等地陆续检出SVA，隐性感染率极高，给我国养猪行业带来了潜在的危害。SVA与其他水疱病在临床症状上难以区分，还需要依靠实验室诊断技术。目前国内外尚无SVA疫苗的应用，ELISA检测出抗体阳性即为感染。而间接ELISA方法具有敏感度高、特异性强、重复性和稳定性好以及成本低、操作简单等优点，适用于基层的检测。目前，已有针对VP1和VP2蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法[21,25-26]，但市场上仍缺少商品化可用试剂盒。本研究以VP3蛋白作为包被抗原，建立了检测SVA抗体的间接ELISA方法。本方法与常发猪病毒病阳性猪血清无交叉反应，对检测SVA阳性血清具有特异性；阳性血清检测结果与中和试验基本一致，具有良好的敏感性；批内和批间的变异系数均在9%以内，具有良好的重复性和稳定性。为临床血清SVA抗体检测提供了成本低、操作简单的技术手段，同时也为不同蛋白所建立的间接ELISA方法的对比奠定了基础。评估本研究方法的敏感性时发现，其敏感性略低于中和试验，可能是中和试验检测所有的中和抗体，而本方法检测的是VP3单一蛋白的IgG抗体[6]，因而两种试验会产生一定差别，但是本研究建立的间接ELISA方法仍具有较高的敏感性。

采用本研究建立的基于VP3蛋白的间接ELISA方法和本实验室已建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法，分别对SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清进行检测。结果显示，两种方法均能在不同时期检测出抗体，但抗体阳性检出率略有差异，免疫后第14天到第35天，VP1较VP3检测出的抗体阳性率略高；从第42天至第63天，VP3比VP1检测出的抗体阳性率略高。目前本实验室正在进行VP2蛋白间接ELISA方法的建立，以期进行不同抗体水平的检测。