高蛋白饲粮对肉鸡肾氧化损伤及黄嘌呤氧化酶基因mRNA表达量的影响

赵 杰，徐静茹，曹 利，朱 雷，刘明达，冯士彬，李 玉，李锦春，吴金节，王希春

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

蛋白质是维持动物机体的物质基础，在动物体内蛋白质的含量处于动态平衡状态，并不是恒定不变的。已有研究表明，饲粮中蛋白质含量会直接影响家禽的健康和生产性能，由于家禽缺乏精氨酸酶，不能将代谢过程中生成的氨转变为尿素，因此蛋白质的代谢只能通过嘌呤核苷酸合成与分解途径进行，最终生成尿酸随尿液排出体外[1-2]。因此家禽摄入的蛋白质过多，会对其机体造成损伤，饲料中添加过多的动物内脏、肉骨粉、鱼粉等动物性蛋白和大豆、蘑菇等植物性蛋白可以诱发禽类高尿酸血症[3-4]。肾是泌尿系统重要的组成器官，负责将血液中的杂质及有害物质过滤排出体外，肾脏一旦出现问题，会使机体内的有毒物质滞留在体内，存在很大隐患[5-6]。家禽的肾脏疾病可造成养禽业较大的经济损失，尤其是禽痛风，目前尚无有效的治疗方法[7]。肾脏原发性损伤是痛风的发病基础，并且会引起机体氧化损伤和相关基因黄嘌呤氧化酶(XOD)表达紊乱[8-9]。适量自由基可以发挥正常的生理作用，但是过量自由基会对机体产生毒副作用，影响动物机体的代谢及基因表达[10-11]。

由于禽痛风发生时肾脏功能变化明显，从而确立了肾脏在痛风发生中的主导地位，甚至有些报道将禽痛风又称为禽肾功能衰竭。但是禽类肾功能异常与机体脂质过氧化及XOD基因表达量之间的相关性研究较少。为此，本试验探讨了高蛋白饲粮对白羽肉鸡肾脏功能、脂质过氧化及XOD基因m-RNA表达量的影响，以期为高蛋白饲粮引起肉鸡肾损伤的发病机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 健康的817白羽肉杂鸡120羽(20日龄)，由安徽省宣城市宣城木子禽业专业合作社提供。

1.1.2 试剂及仪器 丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、羟自由基(·OH)、总抗氧力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和黄嘌呤氧化酶(XOD)ELISA检测试剂盒，购自南京建成生物技术有限公司；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、钙(Ca)、磷(P)和镁(Mg)生化检测试剂盒，购于南京森贝伽生物科技有限公司；Trizol RNA 提取试剂，购自大连宝生物工程有限公司；StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix，购自北京康润诚业生物技术有限公司；BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒，购自杭州倍沃医学科技有限公司。

FSH-2可调高速匀浆器，购于金坛市荣华仪器制造有限公司；TGL冷冻高速离心机，购于珠海黑马医学仪器有限公司；TBA-120FR全自动生化分析仪，购于日本TOSHIBA公司；Arktik多功能PCR仪，购于美国Thermo有限公司；StepOneTMReal-Time PCR System、Moultiskan MK3酶标仪，购于赛默飞世尔仪器有限公司。

1.2 试验设计

将120羽20日龄健康白羽肉杂鸡随机均分为对照组(Ⅰ组)和高蛋白饲粮组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)，每组5个重复，每个重复6羽。Ⅰ组饲喂基础饲粮，其蛋白质含量约为190 g/kg，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在基础饲粮中添加豆粕类添加物，使粗蛋白含量分别约为220，250，280 g/kg，各组饲料组成见表1。对所有的白羽肉杂鸡进行脚标编号，严格记录分组情况。试鸡按常规免疫程序进行免疫。试验鸡采用笼养(70 cm×70 cm×40 cm)模式饲养，每笼6羽，按计划饮食饮水。试验周期为14 d。

表1 不同蛋白含量饲粮组成和营养水平Table 1 Dietary ingredients and nutrient levels for different proteins contents

1.3 样品采集

于试验第0(试验开始当日)，7，14 天，每组随机抽取5羽鸡，每个重复1羽，经翅静脉采血，血液于37 ℃温箱中静置1 h，然后3 000 r/min离心10 min，分离血清，分装标记，-20 ℃保存。于试验第14 天，每组随机抽取5羽试验鸡，每个重复1羽，在无菌条件下采取肾脏组织，于-80 ℃保存待检。

1.4 血清生化指标检测

用全自动生化分析仪对白羽肉杂鸡血清进行肾功能指标检测，测定指标主要包括血清钙(Ca)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血清磷(P)、镁(Mg)含量等。

1.5 血清氧化与抗氧化指标检测

血清氧化与抗氧化指标采用ELISA试剂盒进行检测，测定指标包括血清丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、羟自由基(·OH)含量和总抗氧力(T-AOC)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性等，测定步骤按照试剂盒说明书操作。

1.6 XOD活性检测

采用ELISA试剂盒对白羽肉杂鸡血清XOD的活性进行检测，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.7 XOD基因表达的检测

1.7.1 cDNA的制备及引物设计与合成 将肾脏组织样本分别用液氮研磨粉碎，加入1 mL Trizol试剂，在碎冰上匀浆，12 000 r/min离心15 min取上清液，加入500 μL酚氯仿，混匀，静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清并加入700 μL异丙醇，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取白色沉淀，用体积分数75%的乙醇洗涤1次，置于超净台上风干，溶于50 μL DEPC处理水中，电泳检测。用反转录试剂盒将提取的 RNA 反转录成 cDNA。

根据GenBank中XOD和18S内参基因序列，运用Prime 5.0软件设计特异性上、下游引物序列。相关基因的引物序列见表2。

表2 XOD目的基因和18S内参基因引物参数Table 2 Parameters of XOD target gene and 18S internal gene primer

1.7.2XODmRNA表达的qRT-PCR检测 应用StepOneTMReal-Time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒。根据试剂盒说明书进行操作，将调配的PCR反应液置于8联管中，用超净管盖封闭，进行RT-PCR反应。PCR反应体系为50 μL：qPCR反应混合物(BestarTMSybrGreen)25 μL，上、下游引物各2 μL，模板2 μL，用ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性120 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；55 ℃ 1 min，55～98 ℃ 0.05 ℃/s，20 ℃ 10 s。利用2-ΔΔCt方法进行相对定量，计算样品的相对表达量。

1.8 数据处理

试验结果以“平均数±标准差”表示；采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 高蛋白饲粮对肉鸡肾功能指标的影响

高蛋白饲粮对肉鸡血清肾功能指标的影响如表3所示。

表3 高蛋白饲粮对肉鸡血清肾功能指标的影响Table 3 Effects of high protein diet on serum renal function of broilers

由表3可知，试验开始当日(第0天)，各试验组肉鸡各项指标与对照组相比差异不显著(P>0.05)。第7天，与对照组(Ⅰ组)相比，各高蛋白质组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)肉鸡血清UA含量差异不显著(P>0.05)；与对照组(Ⅰ组)相比，Ⅱ、Ⅲ组肉鸡血清中BUN、CREA含量差异不显著，而Ⅳ组BUN、CREA含量极显著上升(P<0.01)；与对照组(Ⅰ组)相比，Ⅱ组Ca差异不显著，而Ⅲ和Ⅳ组Ca含量显著升高(P<0.05)。第14天，与对照组(Ⅰ组)相比，Ⅱ组肉鸡血清中UA、BUN和CREA含量差异不显著，Ⅲ和Ⅳ组肉鸡血清中UA、BUN和CREA含量显著或极显著上升(P<0.05或P<0.01)；而各组之间Ca含量差异不显著(P>0.05)。在试验期间，各组肉鸡血清P、Mg含量变化不显著(P>0.05)。

2.2 高蛋白饲粮对肉鸡脂质过氧化指标的影响

由表4可知，第0 天，各高蛋白试验组肉鸡各项指标与对照组差异不显著(P>0.05)；第7 天，与对照组(Ⅰ 组)相比，各高蛋白组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)肉鸡血清MDA含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，Ⅱ组与Ⅲ组血清·OH和NO含量差异均不显著(P>0.05)，而Ⅳ组血清·OH、NO含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)；第14 天，Ⅳ组血清MDA、·OH与NO含量较对照组极显著升高(P<0.01)，其他各组无显著差异(P>0.05)。与对照组(Ⅰ组)相比，第7 和14 天，Ⅳ组血清SOD活性以及GSH-PX、T-AOC含量显著下降(P<0.05)；第7天，Ⅲ组血清GSH-PX、T-AOC含量显著下降(P<0.05)。

表4 高蛋白饲粮对肉鸡血清脂质过氧化指标的影响Table 4 Effect of high protein diet on serum lipid peroxidation index in broilers

2.3 高蛋白饲粮对肉鸡血清XOD活性的影响

由表5可见，试验第0 天，4组肉鸡间黄嘌呤氧化酶活性无显著差异(P>0.05)；试验第7天，Ⅱ组肉鸡血清XOD活性与对照组无显著差异(P>0.05)，而Ⅲ组与Ⅳ组肉鸡血清XOD活性显著高于对照组(P<0.05)；试验第14天，Ⅳ组肉鸡血清XOD活性显著高于对照组(P<0.05)，其余各试验组与对照组均无显著差异(P>0.05)。

表5 高蛋白饲粮对肉鸡血清XOD活性的影响Table 5 Effect of high protein diet on serum XOD activity in broilers

2.4 XOD基因mRNA表达水平检测

高蛋白饲粮对肉鸡肾组织XOD基因mRNA相对表达量的影响见图1。

由图1可知，试验第14 天时，随着饲粮中蛋白质含量的增加，Ⅲ、Ⅳ组肉鸡肾组织中XODmRNA的相对表达量与对照组相比均显著升高(P<0.05)。

3 讨 论

通常情况下，禽类更容易自发或被诱发高尿酸血症，因此在高尿酸血症模型的建立及研究方面，禽类具有突出地位。患鸡呈现运动能力下降、不能站立等症状，这常见于因代谢不均衡、机体内电解质不平衡引发的腹泻症状，而内脏型痛风表现并不明显。痛风的禽类粪便为白色稀便，饮食和运动能力减退，有些病鸡死亡，解剖病死鸡可见到肾脏和输尿管部位有明显的病理变化或尿酸盐沉积[12-13]。本试验发现，高蛋白饲粮饲喂的白羽肉杂鸡肾功能指标出现异常变化且呈现增高趋势，说明随着蛋白质含量的提高，饲粮对鸡肾功能的不良影响越来越强[14-15]。

一般认为，动物体内Ca和P之间有拮抗作用，适量的高蛋白饲粮可增加肉鸡体内Ca含量，如果在动物体生长过程中过量饲喂蛋白质，反而会导致机体内Ca流失，同时会增加肾脏的工作负荷，从而导致肾脏疾病，这在禽类中比较常见[16]。本试验在第7 天时，Ⅲ、Ⅳ组肉鸡血清Ca含量显著上升，第14 天时，各组血清Ca含量无显著差异，这可能与大量蛋白质的摄入引起肾脏Ca排泄增加有关。禽类摄入大量富含核蛋白质和嘌呤碱的蛋白质饲料时，饲料中的蛋白质在体内消化吸收分解最终生成UA，而饲料中高蛋白会引起Ca异位沉着，UA排出受阻，导致血清UA水平升高[17]。本试验结果显示，与对照组相比，高蛋白组UA显著升高，该结果与唐建霞等[18]的研究结果一致，其原因可推测为饲料中高蛋白会引起Ca异位沉着，UA排出受阻，使体内UA升高。本试验结果显示，与对照组相比，高蛋白饲粮组肉鸡血清Mg含量变化不显著，表明高蛋白质的饲喂对Mg含量影响不显著，与预期相符。CREA是机体组织代谢的产物，血液中的CREA主要由2个途径产生：外源性和内源性，一般CREA的变化以外源性为主[19]。CREA可反映肾脏损害、肾小球滤过率等功能；机体组织代谢的另一个产物为BUN，当BUN超出正常范围时标志着肾代谢压力增加，出现了氮质血症，肾功能不全[20-21]。本试验发现，在大量摄入高蛋白饲粮后，肉鸡第7和14天时可以观察到血清CREA含量增加显著。

高蛋白饲粮可致鸡体内Ca含量增加，引发水和电解质代谢紊乱，导致高钙血症以及脂质过氧化指标发生变化，最终引发痛风[18]。由于结构特殊，·OH具有极强的氧化能力。除·OH外，MDA和NO也是反映氧化能力的主要指标。SOD、T-AOC、GSH-Px是体内自由基的清除剂，也是机体内抗氧化能力的主要指标[22]。本试验中，在第7和14 天，血清·OH、MDA和NO均呈现280 g/kg粗蛋白组肉鸡显著高于对照组、 220 g/kg粗蛋白组和250 g/kg粗蛋白组的情况，从对照组到高蛋白组呈上升趋势，并且第7 和14 天·OH、MDA、NO 3个氧化指标均呈现280 g/kg粗蛋白组显著高于250 g/kg粗蛋白组的情况，说明肉鸡血液中的氧化能力有所增强。自由基是动物体内自带的一种物质，一般认为自由基会导致机体衰老和功能的减退，而在动物体内，当自由基与不饱和脂肪酸等结合在一起的时候，导致体内不饱和脂肪酸直接损坏膜的结构，从而引起机体组织的损伤，自由基如果超过一定的量就会对机体产生毒副作用。氧化功能与抗氧化功能相互抑制，MDA活性经常被用作氧化损伤的衡量指标，并被用作反映自由基诱导的脂质过氧化水平。T-AOC是反映血清和组织中所有抗氧化剂抗氧化能力的综合指标，体现了机体抗衰老和抵御外界损伤的能力[23-24]。动物体内的自由基和氧化剂会使机体内细胞和组织结构受损，影响器官功能，在人体中的主要表现有心脑血管损伤、氧化能力增强或者抗氧化能力减弱，从而造成氧化应激反应[19]。试验第14 天时，高蛋白组肉鸡的氧化指标MDA、NO、·OH均显著高于对照组，且整体呈现增加趋势，而抗氧化指标SOD、GSH-Px和T-AOC均较对照组显著减少，说明机体的氧化能力在增强而抗氧化能力在下降。因此在本试验中，随着蛋白质含量的增加，机体氧化能力增强而抗氧化能力减弱，呈现剂量依赖性。

XOD作为动物体内的一种代谢酶，催化产生超氧自由基和过氧化氢，是体内活性氧的一个重要来源[25]。在本试验中可以观察到，随着试验鸡摄入饲粮蛋白质含量的增加，XODmRNA表达量也随之增加，说明高蛋白饲粮的摄入会引起相关基因的表达，且蛋白质含量越高基因表达越明显。此外，XOD与尿酸及自由基的产生密切相关，其可以将代谢产生的次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，再将黄嘌呤氧化成UA，随着XOD的增加，动物体内尿酸沉积越来越明显，肾脏损伤也越来越严重[26]。经试验证实，高蛋白饲粮能提高肉鸡XODmRNA表达量，进而导致尿酸及自由基的产生和增加。

4 结 论

综上所述，饲喂高蛋白饲粮可造成肉鸡血清肾功能相关指标出现异常，血清XOD活性、肾组织XODmRNA表达量显著升高，血清氧化指标MDA、NO、·OH含量上升，抗氧化指标T-AOC、GSH-PX、SOD活性下降，产生氧化应激，血清UA、BUN、GREN等指标显著升高，Ca含量呈上升趋势，表明高蛋白饲粮会对肉鸡造成一定的肾氧化损伤。