不同亚型胃食管反流病患者呼气中挥发性标志物的筛选

阿丽叶古丽·艾皮热阿卜杜喀迪尔 买买提·依斯热依力 王俭 克力木·阿不都热依木，

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是胃内容物反流入食管引起不适症状和（或）并发症的一种慢性消化系统疾病，烧心和反酸是其典型症状，也可以表现为非典型的食管外症状，如非心源性胸痛、慢性咳嗽、哮喘或咽喉炎等[1]。因此大部分患者早期选择去心内科、呼吸科或耳鼻喉科等科室就诊，无法早期明确诊断，延误治疗时机。目前，GERD的诊断是要结合临床症状、抑酸反应、上消化道内镜检查、食管pH值监测及上消化道造影等客观检查结果来综合诊断，此综合诊断容易受到主观因素的影响和具有侵入性，推广具有一定的局限性，此外，医疗费用也较高[2]。因此，大部分患者的配合度不高。目前，在临床迫切需要研究一种简便、快捷、无创、无痛、经济、省时的快速筛查方法。

人体呼气分析是一种简单、无创、无痛的新兴技术，可用于疾病诊断，疗效评估，并可提供潜在的疾病发病机制线索。人体呼出气体中有3 000余种挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs），它们直接或间接地与机体病理生理过程有关，这提供了窥视人体新陈代谢的“窗口”。近年来，随着气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等代谢组学分析平台的灵敏度、分离能力及稳定性提高，呼气分析在临床疾病诊断中得到广泛应用[3-8]。因此，本研究利用固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）联用GC-MS技术分析GERD及健康对照人群的呼气成分，筛查GERD中的差异性VOCs，并进一步评价其对GERD诊断的价值，为GERD的早期诊断提供新的方法。

对象与方法

一、一般资料

收集2019年11月至2020年10于新疆维吾尔自治区人民医院住院治疗的97例GERD患者及29例健康体检的人群作为研究对象。完整地记录每位研究对象的胃镜结果，24 h pH监测结果，年龄、性别、身高、体质量、体质量指数（body mass index，BMI）等相关临床检查结果及资料。所有研究对象签署知情同意书。本研究已通过我院伦理委员会批准（批号为2018D01C119）。

二、纳入与排除标准

1.GERD纳入标准：内镜结果不正常；有酸反流。

2.非GERD纳入标准：内镜结果正常，食管24 h pH监测结果为生理性酸反流。

3.排除标准：贲门失弛缓症；孕妇或哺乳期妇女；有严重的胃食管器质性病变；有严重的心肺疾病；糖尿病；肾衰竭尿毒症期或患有可引起GERD相关症状的其他疾病；拒绝签知情同意书者。

三、分组方法

29例健康体检的人群分为对照组。97例GERD患者分为糜烂性食管炎伴病理性酸反流（erosive esophagitis+24 h pH+，EE+24 h pH+）、糜烂性食管炎伴生理性酸反流（erosive esophagitis+24 h pH-，EE+24 h pH-）、非糜烂性反流病（nonerosive reflux disease，NERD）、Barrett食管（Barrett's esophagus，BE）

1.EE+24 h pH+组：内镜结果属于EE，包括LA-A～D级[9]，食管24 h pH监测结果为病理性酸反流。

2.EE+24 h pH-组：内镜结果为EE，食管24 h pH监测结果为生理性酸反流。

3.NERD组：内镜结果为非糜烂性反流病（non-erosive reflux disease，NERD），食管24 h pH监测结果为病理性酸反流。

4.对照组：内镜结果正常，食管24h pH监测结果为生理性酸反流。BE组：内镜结果属于Barrett食管（Barrett's esophagus，BE），BE是内镜下可见的食管柱状上皮化生，病理结果为一种特殊的肠化生上皮[10]。贲门失弛缓症、孕妇或哺乳期妇女、有严重的胃食管器质性病变、有严重的心肺疾病，糖尿病，肾衰竭尿毒症期或患有可引起GERD相关症状的其他疾病、拒绝签知情同意书者均排除。

四、研究方法

采用无菌铝箔复合膜呼气采集袋（东莞市康迪包装公司）收集呼气标本，受试者当天零点开始禁食水，晨起后到收集向集气袋吹气直至气袋充满为止（勿深呼气，勿断续吐气）。SPME萃取头（PDMS/DVB 65 μm PK3，北京康林科技有限责任公司）每次使用前加热预处理，在250℃条件下加热30 min以除去残留物质；在室温萃取20 min，萃取过程中标本放入60℃的水浴加热；立即接到GCMS联用仪器（美国Agilent 7890-5975C）进样本；色谱条件为 Agilent HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm，北京飞美斯分析科技有限公司），高纯氦气（纯度：99.999%）载气，柱流量1.0 ml/min。程序升温条件初始柱温40℃，保留2min，以3℃/min升温至250℃，维持10 min。进样口温度为250℃，不分流。质谱条件为电离方式EI，碰撞能量为70 ev，离子源温度230℃，全扫描（30～800 m/z）。将原始数据导入MPP软件（Agilent G3835AA MassHunter Mass Profiler Professional）进行分析。定量分析方法使用目前应用较广泛的内标比值法，统一将CO2的峰面积作为基数，把其他VOCs的峰面积定量化（I'm=Im/ICO2×109）。Im代表某VOCs的峰面积，I'm为归一化后的相对定量数据[11]。

五、评价指标

1.主成份分析（principal component analysis，PCA）分析：用于不同亚型GERD与非GERD组别间的区分。

2.诊断效果评价采用受试者工作特征（ROC）曲线分析：测出指标曲线下面积，确定CUT-OFF值和约登指数，得出诊断指标的灵敏度和特异度。

六、统计学方法

应用SPSS 23.0软件对相关数据进行统计描述和分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较用Mann-Whitney U检验；计数资料用例数表示，组间比较用χ2检验或Mann-Whitney U检验；灵敏度和特异度用于检验诊断模型价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、纳入本研究的一般临床资料

本研究共纳入126例研究对象，其中EE+24 h pH+组24例，EE+24 h pH-组28例，NERD组36例，对照组29例，BE组9例。GERD不同亚型组患者体重、BMI与对照比较差异无统计学意义（P＞0.05），（见表1）。

表1 各组基础资料与对照组比较

二、GC-MS结果

1.PCA分析：从各组数据的PCA得分图可以看出，EE+24 h pH+组、EE+24 h pH-组、NERD组、BE组与对照组之间分离较好，样本全部处于95%置信区间内（见图1）。

图1 各组样本PCA得分图

2.GERD-组与对照组间的差异性代谢物：MPP软件分析GERD组与对照组所有样品，共检测到184个化合物。其中，两组间有差异的化合物有4个。将化合物带回Masshunter软件，筛选出峰形较好、差异显著的化合物，利用NIST14（http://webbook.nist.gov/chemistry）质谱数据库对可能的标记物做鉴定，匹配度大于90%的鉴定结果较为可信（见表2）。

表2 GERD差异代谢物鉴别结果

3.不同亚型GERD组与对照组间的差异性代谢物：MPP软件分析EE+24 h pH+组与对照组所有样品，共检测到164个化合物。组间比较用Mann-Whitney U检验，找到差异有统计学意义的差异化合物4个（P＜0.05）。EE+24 h pH-组与对照组样品共检测出161个化合物，其中差异性化合物有3个。NERD组与对照组样本共检测到153个化合物，其中有差异化合物4个。BE组与对照组样本共检测到126个化合物，但无差异性化合物。将所有化合物带回Masshunter软件，筛选出峰形较好、差异显著的化合物，利用NIST14质谱数据库对可能的标记物做鉴定，匹配度大于90%的鉴定结果较为可信（见表3）。

表3 不同亚型GERD的差异代谢物鉴别结果

三、验证差异性VOCs对GERD诊断的可行性

本研究在GERD中鉴定出了正十二烷、正十六烷、5-甲基-十一烷、5-乙基癸烷等4种差异性VOCs。通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线评价它们用于诊断GERD的价值。5-乙基癸烷诊断GERD的灵敏度可达80.9%，特异度可达47.61%，曲线下面积0.603，无统计学意义（P＞0.05）。5-甲基-十一烷诊断GERD的灵敏度可达88.40%，特异度可达48.4%；正十二烷和正十六烷诊断GERD的灵敏度可达91.20%，特异度可达53.86%（见表4和图2）。因各GERD亚型组样本量较少，无法进一步评估其VOCs在诊断GERD亚型中的作用，需要大样本研究来进一步评估。

表4 正十二烷、正十六烷、5-甲基十一烷、5-乙基十一烷的诊断价值

图2 正十二烷、正十六烷、5-甲基十一烷、5-乙基十一烷的ROC曲线

讨 论

GERD是由功能性或器质性因素导致胃食管连接处抗反流屏障的减弱或破坏，导致的食管暴露于酸性反流物中，并对食管造成器质性损伤的疾病。这不但影响患者的日常生活质量，严重时还会引发包括BE，乃至食管腺癌、贲门癌等多种恶性消化系统疾病[1，12-14]。GERD根据内镜和组织病理学表现可分为NERD、EE及BE三种不同表型，其中，NERD最常见，占约60～70%，其次为EE（30%）和BE（6%～12%）[2]。GERD诊断一般是结合临床症状、抑酸反应、内镜检查、食管pH监测以及上消化道造影等客观检查结果来综合诊断。其中，GERD调查问卷法是患者对典型症状“反酸、烧心”的自我描述，结果易受到主观因素的影响。胃镜作为进一步明确诊断GERD的传统检查手段，虽然特异度较高，但是敏感性较低，特别是对NERD患者诊断存在一定的局限性，同时胃镜是侵入性检查，易引起患者不适。食管24 h pH监测虽然能补充内镜检查的缺点等，但是仍属于侵袭性检查，需坚持24 h，患者的配合度不高，而且医疗费用较高[2]。因此，临床迫切需要研究一种简便、快捷、无创、无痛、经济、省时的快速筛查方法。

本研究利用GC-MS技术检测GERD及健康对照人群呼气样本，共鉴定出正十二烷、正十六烷、5-甲基-十一烷、5-乙基癸烷等4种差异性VOCs。在不同亚型GERD患者中，EE+24 h pH+中鉴定出正十四烷、正十六烷、5-甲基-十一烷及5-丙基壬烷等4种差异性代谢物，其中正十六烷和5-甲基-十一烷与GERD组结果重叠，而正十四烷和5-丙基壬烷在此组中特异的差异性VOCs，因此初步可以认为正十四烷和5-丙基壬烷为EE+24 h pH+的标志性代谢物。EE+24 h pH-鉴定出5-甲基-十一烷、5-丙基壬烷及5-乙基癸烷等3种差异性代谢物，其中5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷与EE+24 h pH+患者呼气结果一致，而5-乙基癸烷在EE+24 h pH-中独有，因此初步可以认定5-乙基癸烷是EE+24 h pH-的标志性VOCs。说明5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷无论有无pH+，在EE中均表现出差异性，故5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷可能是EE的标志性VOCs。在NERD中共鉴定出了邻三氟甲基苯甲酸、2-甲基-十一烷及正十二烷等3种差异性VOCs。其中正十二烷跟GERD组与对照组结果一致。因此，NERD可能的标志性VOCs可能是三氟甲基苯甲酸和2-甲基-十一烷。BE未筛选出差异性的VOCs，可能是与样本量有关。

人体产生的内源性VOCs主要包括烷烃类、烯醇类、芳香族类等，这与体内肠道菌群改变有关[15]。在GERD中检测的特异性VOCs的病理生理机制目前尚未明确。可能与GERD患者体内微生物代谢的改变有关，因此它也可能是GERD中VOCs产生的机制之一。

本研究对筛选出来的4种VOCs作ROC曲线，评价这4种VOCs的诊断价值，结果显示5-乙基癸烷诊断GERD的灵敏度和特异度无统计学意义，因此5-乙基癸烷在诊断GERD中无参考价值。5-甲基-十一烷、正十六烷这2种标志性VOCs诊断GERD的敏感性良好，但是它们特异度均较低，曲线下面积在0.6～0.7之间，诊断价值较低。只有正十二烷灵敏度较高，曲线下面积大于0.7，参考价值中等，因此5-甲基-十一烷，正十二烷和正十六烷可作为早期筛选GERD及健康人群的标志性VOCs，其中正十二烷可能作为早期诊断GERD的新参考指标。