雷公藤红素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 的抑制作用研究

史晓娜 徐 霞 谢闺娥

广州医科大学金域检验学院，广东广州 510182

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一[1-2]。其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是孕激素受体、雌激素受体和人表皮生长因子受体-2 都呈阴性表达的乳腺癌，复发率和远处转移率高，临床预后较差[3]。化疗药物是对抗包括TNBC 在内的乳腺癌的重要手段[4-5]，然而肿瘤耐药性的产生严重影响治疗效果[6-7]，因此，探索新型化疗药物已成为乳腺癌治疗的一个重大课题。

雷公藤红素又名南蛇藤素，分子式为C29H38O4，分子量为450.61，结构式如图1 所示。雷公藤红素有抗炎[8]、抗氧化[9]、免疫抑制[10]及抗肿瘤活性[11-13]等多种药理活性。它能抑制多种肿瘤细胞的生长，但其对乳腺癌的作用及其机制尚未完全明确。本研究探索雷公藤红素对生物学特性与TNBC 最接近的MDA-MB-231细胞[14]的抗肿瘤作用，以期为探索抗乳腺癌的化疗新药提供依据。

图1 雷公藤红素结构式

1 材料与方法

1.1 材料

人MDA-MB-231 乳腺癌细胞系来自美国模式培养物保藏所；雷公藤红素（Sigma，批号：042M4608V）；TUNEL 试剂盒（Roche，批 号：39006700）、Annexin V细胞凋亡试剂盒（BD Pharmingen，批号：6301518）；p-AKT、AKT、Bcl-xL 及Survivin 抗体（Cell Signaling，货号分别为9271、9272、2762、2803）。

酶标仪（Synerge-HTX，BioTek）；荧光显微镜（Cytation5，BioTek）；流式细胞仪（FACS Canto Ⅱ，Becton Dickinson）。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制 雷公藤红素溶解于二甲基亚砜，配制成10 mmol/L 母液，-20℃避光贮存。

1.2.2 细胞培养 MDA-MB-231 于37℃、5% CO2培养在含10%胎牛血清的DMEM 中。

1.2.3 MTT 比色 MTT 实验方法参照本课题组前期研究论文中所述[15]。

1.2.4 Annexin V-FITC 荧光染色 实验分为两组：对照组和处理组。对照组未经任何处理，处理组用2.0 μmol/L 雷公藤红素作用后，消化细胞，洗涤重悬后，加入Annexin V-FITC 与碘化丙啶（propidium iodide，PI），室温避光孵育15 min 后在流式细胞仪上检测凋亡情况。

1.2.5 TUNEL 染色 固定细胞并用Triton X-100 打孔，加rTdT 反应液37℃孵育1 h；再加PI 室温避光孵育15 min；PBS 洗涤，干燥后用荧光显微镜进行观察，绿色荧光信号为TUNEL 染色阳性。

1.2.6 免疫印迹法（Western blot）取30 μg 细胞总蛋白电泳后电转印PVDF 膜，封闭后加1∶500 稀释的一抗于4℃反应过夜，第2 天洗涤后，用1∶1000 稀释的HRP 标记的二抗在室温孵育1 h，ECL 法发光显影。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素对MDA-MB-231 生长的影响

MTT 比色表明，雷公藤红素能抑制MDA-MB-231的生长，其抑制作用呈浓度依赖性，作用48 h 后，半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为0.93 μmol/L。见图2。

图2 雷公藤红素对MDA-MB-231 的生长抑制曲线

2.2 雷公藤红素对MDA-MB-231 凋亡的影响

Annexin V-FITC 染色结果显示，处理组凋亡细胞比率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 Annexin V-FITC 荧光染色检测雷公藤红素对MDA-MB-231 的凋亡诱导作用

TUNEL 染色结果显示，处理组TUNEL 阳性细胞比率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

2.3 雷公藤红素对Akt 信号通路的调节

Western blot 试验表明，与对照组比较，处理组p-Akt、Survivin 和Bcl-xL 的蛋白表达下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）；两组Akt 总蛋白表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图5。

图5 雷公藤红素对MDA-MB-231 细胞Akt 信号通路的影响

3 讨论

雷公藤红素可抑制多种肿瘤的生长[11-13,16-18]，但其对乳腺癌的作用及其机制尚未完全明确。本研究提示雷公藤红素能抑制MDA-MB-231 乳腺癌细胞的生长，作用48 h 的IC50为0.93 μmol/L。

乳腺癌的发生及其化疗抵抗可能与细胞凋亡异常有关[19-21]。本研究中处理组凋亡细胞比率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示雷公藤红素能诱导MDA-MB-231 细胞发生凋亡。

Akt 通路是调节细胞凋亡[22]和乳腺癌化疗敏感性[23-25]的关键信号通路。本研究表明雷公藤红素能抑制Akt 磷酸化。Survivin[26]和Bcl-xL[27]是Akt 下游的凋亡抑制分子。雷公藤红素作用后，伴随Akt 去磷酸化，Survivin 和Bcl-xL 的表达随之降低。

本研究揭示了雷公藤红素对MDA-MB-231 的生长抑制作用，但不足之处在于仅探讨了这一种乳腺癌细胞系，没有以正常乳腺上皮细胞系如MCF-10A 作为对照，也没有阳性药物对照，后续本课题组会继续完善和深入雷公藤红素抗乳腺癌作用研究，以期为探索抗乳腺癌新药提供更充分的实验依据。