miR-92b在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

张文静 马君 许弘邦

肺癌作为呼吸系统高发恶性肿瘤，发病率和死亡率均高居我国恶性肿瘤首位，且发病率呈不断升高趋势[1]，对人群生命安全构成严重威胁，已成为我国重要的公共卫生问题。其中，非小细胞肺癌是最为常见的类型，约占肺癌的85%左右[2]，且该类型的肺癌早期缺乏典型症状，在我国有超过2/3的患者临床确诊时已无法进行手术治疗[3]，患者总体预后较差，5年生存率较低[4]。因此，积极探讨影响非小细胞肺癌患者预后的相关机制，寻找诊疗的敏感基因，对改善患者预后，提高生存率，具有重要意义。微小RNA(micro RNA，miRNA)作为广泛存在于真核生物体内的高度保守的小分子非编码RNA，可通过调控miRNA降解或抑制功能蛋白翻译，而在细胞增殖、分化、生长、凋亡等生理过程中发挥重要作用，近年来研究发现[5]，其与恶性肿瘤发生、进展、侵袭、转移过程密切相关[6]。miR-92b作为miRNA重要类型，已有研究表明其参与了恶性肿瘤发生及进展[7]。本研究分析了非小细胞肺癌组织中miR-92b表达，探讨其与临床病理指标相关性及对患者预后的影响。

资料与方法

一、临床资料

选取2012年4月至2014年4月在山东省立第三医院接受手术治疗的非小细胞肺癌患者，纳入标准：①均在术前完善相关检查，具体手术适应症，未接受任何治疗，术后病理检查确证是非小细胞肺癌；②临床资料完整。共纳入103例，男性62例，女性41例，年龄36～74岁，平均(58.82±8.6)岁，组织学类型：鳞癌41例，腺癌62例；肿瘤直径：>3 cm 38例，≤3 cm 65例；TNM分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期38例，Ⅲ期19例； 58例出现淋巴结转移。留取非小细胞肺癌组织及距离肿瘤边缘在5 cm以上的癌旁组织，保存于液氮中。本研究通过山东省立第三医院伦理委员会批准，所有患者均行知情同意。

二、方法

1 主要试剂和设备

Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂和PCR扩增试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，引物序列由上海权阳生物科技有限公司，StepOnePlus型实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

2 实验方法 取组织，剪碎、研磨，细胞裂解液裂解，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，并检测其纯度，合格标准：A260/A280位于1.80～2.20。使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，条件：30℃ 10 min，95℃ 5 min。按PCR扩增试剂盒说明，以cDNA为模板，用实时荧光定量PCR仪对引物进行扩增，引物序列：miR-92b：上游：5′-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3′，下游：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6：上游：5′-CTCGCTYCGGCAGCAC-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循环38次。用2-ΔΔCt法计算非小细胞肺癌和癌旁组织中miR-92b表达量[8]。

3 病例随访 于术后第1 d起对患者进行随访，包括住院期间查房，以及出院后门诊复诊、电话、病历追踪等。截止日期2019年4月30日，患者死亡时终止随访，其余患者均随访满5年(60个月)，记录患者5年内发生死亡事件数及生存时间。

三、统计学方法

结 果

一、非小细胞肺癌和癌旁组织中miR-92b表达

miR-92b在非小细胞肺癌组织中表达量为(2.31±0.15)，而在癌旁组织中则为(1.01±0.10)，差异有统计学意义(t=85.839，P<0.001)。

二、不同临床病理指标的非小细胞肺癌患者组织中miR-92b表达

miR-92b在不同年龄、性别、是否吸烟、不同组织学类型和肿瘤直径的非小细胞肺癌患者组织中的表达量间差异无统计学意义(P>0.05)，与TNM分期Ⅰ期和未发生淋巴结转移的患者相比，miR-92b在TNM分期Ⅱ～Ⅲ期和发生淋巴结转移患者组织中表达量升高(P<0.05)(见表1)。

表1 不同临床病理指标的非小细胞肺癌患者组织中miR-92b表达比较

三、非小细胞肺癌患者组织中miR-92b表达量与预后的相关性

103例非小细胞患者随访期间死亡71例，随访时间1～60个月，中位随访时间，以miR-92b在非小细胞肺癌患者组织中表达量的P25值为界值，患者分为低表达组(n=26)和高表达组(n=77)，生存分析结果显示，低表达组5年累积生存率为57.69%，平均生存时间为(46.46±3.45)个月，高表达组分别为19.48%和(28.00±2.19)个月，差异有统计学意义(χ2=13.395，P<0.001)(见图1)。

四、影响非小细胞肺癌患者预后的相关因素

变量赋值(见表2)。结果显示，TNM分期、淋巴结转移和miR-92b表达是影响非小细胞肺癌患者预后的风险因素(HR=2.409、3.055和2.069，P<0.05)(见表3)。

图1 非小细胞肺癌患者组织中miR-92b表达对预后影响的Kaplan-Meier图

表2 变量赋值

表3 影响非小细胞肺癌患者预后的多因素分析

讨 论

近年来，虽然新的诊疗技术不断应用于临床，但由于多数非小细胞肺癌患者发现时已进展至中晚期，治疗效果依然不佳，预后生存率较低[9]。因此，

积极寻找有助于非小细胞肺癌患者早期诊疗的分子学指标及治疗靶点，对患者早期诊断及改善预后具有重要意义。随着研究深入，miRNA在恶性肿瘤发生、进展、侵袭和转移中的作用越来越被重视[10]。有研究指出[11]，非小细胞肺癌患者组织中存在miRNA表达谱异常。miR-92b是miR-106a-363基因簇成员之一，有研究指出[12]，其在食管鳞状细胞癌组织中表达异常，且与病理分级强烈相关。王宇等[13]指出，神经胶质瘤组织中miR-92b表达量显著增加，且与肿瘤细胞生物学功能有关。Wu等[14]研究发现，miR-92b失调与骨肉瘤有关，在骨肉瘤组织中表达上调，且与晚期肺转移和淋巴结转移有关。本研究结果显示，miR-92b在非小细胞肺癌组织中的表达量高于癌旁组织，说明miR-92b在非小细胞肺癌组织中呈高表达。本研究结果显示，与TNM分期Ⅰ期和未发生淋巴结转移的患者相比，miR-92b在TNM分期Ⅱ～Ⅲ期和淋巴结转移的组织中表达量明显升高，说明miR-92b表达可能与恶性进展的临床病理指标有关。

Zhou等[15]指出，miR-92b高表达与胆管癌患者不良结局有关。Wang等[16]研究指出，miR-92b过表达与肝细胞癌预后较差有关。本研究结果显示，低表达组患者5年累积生存率和平均生存时间均高于高表达组，说明miR-92b表达量与非小细胞肺癌患者预后有关，miR-92b高表达可影响患者5年累积生存率及生存时间。多因素分析结果进一步说明miR-92b高表达是影响非小细胞肺癌患者预后的风险因素，提示miR-92b可能是评估非小细胞肺癌预后的潜在生物学标志物，但miR-92b具体是如何参与非小细胞肺癌发生、进展过程，以及如何对患者生存时间产生影响，尚需进一步开展相关实验研究予以明确。

综上所述，miR-92b在非小细胞肺癌组织中表达量升高，且与不良预后有关，是影响预后的独立风险指标，有望成为患者预后评估的潜在标志物，但具体机制有待开展相关的实验研究进行验证。