祛风颗粒提取工艺及薄层色谱研究Δ

2021-03-07龚春燕曹月霞李新宇

中国医院用药评价与分析 2021年1期

余辉，龚春燕，江丽，曹月霞，李新宇#

(1.中国医学科学院皮肤病医院药剂科，江苏南京 210042； 2.中国医学科学院皮肤病医院药物研究室，江苏南京 210042)

祛风颗粒是中国医学科学院皮肤病医院获得江苏省食品药品监督管理局备案号的传统中药制剂(备案号为：苏药制备字Z20200003000)，该方以君药黄芪、防风、荆芥、升麻和浮萍祛风升阳固表；以臣药制何首乌、蝉蜕养血祛风止痒；佐以厚朴、茵陈、地肤子、白鲜皮和黄连，行气祛湿；甘草为使药，调和诸药，在临床上用于慢性荨麻疹、皮肤瘙痒等慢性顽固性皮肤病的治疗，效果肯定[1-2]。由于该方在临床上开具为水煎剂，携带储藏不便，遂将其开发为颗粒剂[3]。本课题组用正交设计法对其进行了提取工艺的研究[4]，以干膏率及君药防风中升麻素苷的含量作为综合评定指标[5-6]，并对方中君药、臣药进行薄层色谱研究[7]，筛选出黄芪、制何首乌及黄连3味药材的薄层鉴别作为质控方法。

1 材料

1.1 仪器

薄层硅胶预制板(青岛海洋化工厂)；METTLER AE240S型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；ZF-I型三用紫外分析仪(上海舒源分析仪器厂)；KH-250B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；XL-200 A型多功能摇摆式粉碎机(上海润实电器有限公司)；微量进样器(上海光正医疗仪器有限公司)；Waters 2695 HPLC型高效液相色谱仪，数据处理软件系统为Waters Empower 2软件，检测器为Waters 2998 PDA检测器，购自沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 药品与试剂

黄连(三角叶黄连)对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120913-201611)；制何首乌对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121454-201405)；黄芪(蒙古黄芪)对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120974-201612)；升麻素苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111522-201712)；三批祛风颗粒中试样品(批号：180701、180702及180703)。

2 方法与结果

2.1 提取工艺研究

方中黄芪、防风和荆芥等中药均为水溶性有效成分，沿用临床使用的水煎剂提取方法，进行提取工艺试验研究。首次提取前用水煎剂步骤浸泡药材30 min，充分浸润药材，并对影响有效成分的3个重要因素加水量、提取次数和提取时间进行正交设计考察，确定最佳提取工艺。

2.1.1 评定指标：为确定是否充分提取有效中药成分，将提取液浓缩、干燥所得的干浸膏得率和君药防风中主要指标成分升麻素苷含量作为综合评定指标。并设定干浸膏得率权重为0.3，有效成分升麻素苷含量权重为0.7，两者加权值为综合评定指标。

(1)干浸膏得率测定。将提取工艺试验得到的提取液浓缩，置于已干燥至恒重的不锈钢皿中，真空干燥箱中60 ℃烘干，称重得干浸膏质量除以药材总质量即得干浸膏得率。

(2)升麻素苷含量测定。①色谱条件。色谱柱为Waters semmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 mm)，检测器为Waters 2998 PDA检测器，以乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱(见表1)，流速为1.0 ml/min，波长为254 nm。②对照品溶液制备。精密称取升麻素苷对照品10.03 mg(纯度分别为96.2%)，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取5 ml置于50 ml容量瓶中，用20%乙腈稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml中含升麻素苷20.06 μg的对照品溶液。③样品溶液制备。取20 g干浸膏粉，精密称定，置于圆底烧瓶中，加75%甲醇100 ml，称定质量，90 ℃回流1 h，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液备用。

表1 洗脱程序

2.1.2 正交设计方案及结果：采用L9(34)正交设计法，对影响有效成分提取的主要因素A(加水量)、B(提取次数)和C(提取时间)进行考察，每个因素设3个水平进行优选，因素与水平见表2。正交试验设计方案与结果见表3。

2.1.3 结果分析：对正交试验结果进行方差分析，见表4。

表2 因素与水平

表3 正交试验设计方案与结果

表4 方差分析结果

查分布表：F0.05(2,2)=19.000，F0.10(2,2)=9.000，因素A、B、C对试验指标均无显著性影响。

对试验结果进行直观分析，根据工艺正交试验方案，最佳提取方案为A3B3C1，但方案A1B3C3、A3B2C1和A3B3C2加权指标值差异不大，对上述3个方案进行重复性试验，每个方案重复3次，对评定指标取平均值，再进行加权指标值计算，结果见表5。

表5 重复性试验结果

根据表5结果，8号试验方案A3B2C1加权指标值最优，与正交试验最优方案A3B3C1比较，减少了1次煎煮步骤，根据正交试验方差分析，试验因素A、B和C对试验指标均无显著性影响，结合实际生产，减少能耗，提高煎煮效率，同时兼顾干浸膏得率和升麻素苷含量，确定A3B2C1因素水平为最终提取工艺，即煎煮提取2次，每次加12倍量水，每次60 min，首次煎煮前浸泡30 min。

2.2 薄层色谱研究

2.2.1 黄芪：取本品10 g，加乙醇30 ml，加热回流20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15 ml使其溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH至5～6，用乙酸乙酯15 ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干。残渣加乙酸乙酯1 ml使其溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典：一部》(2015版)通则0502]，吸取上述2种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇(V∶V=20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后，置紫外光灯(254 nm)下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

B.阴性供试品；S1.供试品(180701)；S2.供试品(180702)；S3.供试品(180703)；R.对照药材B. negative test samples; S1. test samples (180701); S2. test samples (180702); S3. test samples (180703); R. reference samples

2.2.2 制何首乌：取本品10 g，加乙醇50 ml，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至3 ml，作为供试品溶液。另取制何首乌对照药材粉末0.25 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典：一部》(2015版)通则0502]，吸取对照药材溶液5 μl、供试品溶液10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(V∶V∶V∶V=4∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；置氨蒸汽中熏后，有1个相同的红色斑点，见图2。

Ⅰ.365 nm；Ⅱ.氨汽熏蒸；B.阴性供试品；S1.供试品(180701)；S2.供试品(180702)；S3.供试品(180703)；R.对照药材Ⅰ.365 nm；Ⅱ.ammonia fumigation；B. negative test samples; S1. test samples (180701); S2. test samples (180702); S3. test samples (180703); R. reference samples

2.2.3 黄连：取本品10 g，加甲醇25 ml，超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.25 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典：一部》(2015版)通则0502]，吸取对照药材溶液1 μl，供试品溶液5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-三乙胺(V∶V∶V∶V∶V=3∶3.5∶1∶1.5∶1)为展开剂，置于用浓氨试液预饱和20 min的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱图中，在与对照药材色谱相应的位置上，显2个以上相同颜色的荧光斑点，见图3。

3 讨论

本研究在用正交试验优选最佳提取工艺时，综合了直观分析和方差分析。方差分析结果显示，3个试验因素均对评定指标无显著性影响；再进一步对指标值接近的3、8和9号方案各进行了3次重复性试验，各方案试验后的平均指标值显示，8号方案优于3、9号方案。这可能是由于正交试验时各方案仅进行1次试验，在煎煮时指标成分提取不充分造成的，也说明对优选方案进行重复性试验的必要性，最终结合实际生产能耗，优选出最合适的提取工艺。

本研究在进行薄层色谱方法的筛选时，参考《中华人民共和国药典：一部》及文献[8-13]，采用逐味药材筛选和个别药材筛选相结合的办法。例如，黄连中特征成分的薄层色谱斑点明显，不易受到干扰，因此，先用其色谱系统对中试样品颗粒进行了试验，结果显示，方法可行。

本研究在进行制何首乌鉴别方法摸索时，制何首乌的药典处理方法较为复杂，在进行筛选时发现：采用升麻的处理方法处理样品后，再用当归的展开系统展开时，制何首乌的特征斑点明显，且用硅胶G板即可很好地展开，无拖尾现象，较为合适，故调整优化后得到可行的薄层鉴别方法[14-15]。

薄层鉴别试验中还对薄层板进行了耐用性试验，3个不同厂家的硅胶薄层板均重现性良好。