鼻敏片对寒证变应性鼻炎豚鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响Δ

莫华秀，朱镇华，邓晗薇，宾 骥，李凡成

(1.湖南中医药大学第一中医临床学院，湖南 长沙 410208； 2.湖南中医药大学第一附属医院耳鼻喉头颈外科，湖南 长沙 410007)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是易感机体接触致敏原后产生的由免疫球蛋白E(IgE)介导的，以突然和反复发作的打喷嚏、鼻塞、鼻流清涕和鼻痒等为主要症状的鼻部黏膜慢性炎症反应[1]。AR的特点是治疗周期长、发作反复、难以治愈等，临床上易出现鼻部及眼部的伴随症状。近年来，流行病学调查结果发现，全球AR患病率逐年升高，约为10%～40%[2-3]。根据美国2015年AR临床指南的相关索引[4]，避免接触过敏原、药物治疗、手术治疗及特异性免疫治疗是临床上较为常见的治疗手段，其中应用广泛的一线治疗药物是鼻用糖皮质激素和第2代鼻用或口服抗组胺药，虽然其起效较快，但从长期的治疗结果看，其不仅存在易复发、远期效果难以保证等缺点[5]，还使得机体的敏感性降低，从而可能引发不良反应[6-7]。中医对AR的治疗是基于患者的整体，纠正机体阴阳失衡的疾病状态，从而提高机体的免疫功能。中医学认为，该病多因肺脾肾的虚损，风寒之邪乘虚入侵所致，故用鼻敏片治以温肺祛风、补肾健脾、摄津止涕，长期临床应用的疗效显著。本研究旨在以寒证AR豚鼠模型为研究对象，通过检测豚鼠血清中IgE、白细胞介素(IL)17和IL-10的含量，鼻黏膜中辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)、特异性转录因子维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)和叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)蛋白的表达水平，探讨Th17/Treg细胞的免疫机制，为临床上应用鼻敏片治疗AR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：鸡卵清蛋白(索莱宝生物公司，货号：1031H052)；氢氧化铝[Al(OH)3](Thermo Fisher公司，货号：PF201964)；豚鼠IgE、IL-10和IL-17酶联免疫吸附试剂盒(上海晶天生物公司，货号：20190729)；兔抗豚鼠Foxp3蛋白多克隆抗体(bioss公司，货号：BS-10211R)；兔抗豚鼠RORG蛋白多克隆抗体(bioss公司，货号：BS-6217R)；氯雷他定片(上海拜耳医药有限公司，批准文号为国药准字H10970410，批号为JS08187)；鼻敏片由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供。

1.1.2 实验动物：普通级雄性英国种豚鼠40只，体重250～350 g[湖南中医药大学动物实验中心提供，动物批号：SCXK(湘)2014-0010]；正常饲料饮食外给予包菜或胡萝卜。

1.2 方法

1.2.1 造模及给药：将40只豚鼠随机分为4组，即模型组、氯雷他定片组、鼻敏片组和空白组。适应性饲养7 d后，前3组以复方凉药+卵清蛋白(OVA)致敏法复制寒证AR模型，空白组正常饲养。参照陈小野等[8]改良后的复方寒凉药制备寒证模型，采用黄柏-知母-生石膏-龙胆草(质量比为1.5∶2∶1∶1.2)煎制成200%(浓度)的水煎剂灌胃(10 ml/kg)，1只1次4 ml，1日3次，于第17日起改为1日4次灌胃给药，用药28 d。参照AR动物模型(草案)制备豚鼠模型[9]，按卵清蛋白30 mg+[Al(OH)3]3 g+0.9%氯化钠溶液100 ml配制混悬液，每只豚鼠隔日腹腔注射1 ml，共行7次基础致敏。配制2%卵清蛋白(卵清蛋白)0.9%氯化钠溶液，用移液枪进行双侧滴鼻激发，1个鼻孔1次50 μl，1日1次，共行7次滴鼻激发。造模成功后，隔日给予卵清蛋白(卵清蛋白)1 g/L滴鼻以维持模型。造模后，按体表面积法计算给药剂量，氯雷他定片组豚鼠的给药剂量为0.903 mg/kg，鼻敏片(组方：黄芪20 g，白术10 g，防风6 g，麻黄5 g，当归10 g，细辛3 g，巴戟天10 g，淫羊藿10 g，蝉蜕6 g，五味子6 g，白芍10 g，甘草6 g，白蒺藜10 g)组豚鼠的给药剂量为10.117 g/kg，其余两组豚鼠给予0.9%氯化钠溶液4 ml，均灌胃给药，治疗15 d，每日分2次给药。

1.2.2 血清、鼻黏膜的采集及检测方法：用10%水合氯醛溶液(0.1 ml/20 g)麻醉后心脏采血，以3 000 r/min(离心半径为13.5 cm)离心15 min后取血清，并用酶联免疫吸附试验测定其血清IgE、IL-10及IL-17的含量。取一侧鼻黏膜于4%多聚甲醛溶液固定后，经石蜡包埋切片，行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察其病理组织形态。另取一侧完整鼻中隔及黏膜放入Eppendorf管，并移入-80 ℃低温冰箱保存待行Western blot法测定鼻黏膜中RORγt、Foxp3蛋白的表达。

1.2.3 豚鼠行为学评价：依据《实用中医证候动物模型学》《中医虚证诊断标准》等对寒证模型复制是否成功进行评价[8，10]。寒证动物模型表现为畏寒，活动减弱，摄食、饮水量降低，耳廓、爪趾颜色淡(白)，舌唇淡(白)等症状。参照相关文献[11]，对其鼻部症状进行叠加量化法评分，其行为学总分>5分表示造模成功。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 四组豚鼠治疗前后鼻部症状评分比较

治疗前后症状评分结果显示，治疗前，与空白组比较，模型组、氯雷他定片组及鼻敏片组豚鼠鼻部症状评分均显著升高，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；治疗15 d后，与模型组比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠鼻部症状评分显著降低，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；组间比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠鼻部症状评分的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 四组豚鼠治疗前后鼻部症状评分比较分)

2.2 四组豚鼠治疗后血清IgE、IL-10及IL-17水平比较

酶联免疫吸附试验结果显示，治疗后，与空白组比较，模型组豚鼠血清IgE、IL-17含量明显升高，血清中IL-10含量明显降低，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠血清IgE含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，血清IL-10的表达水平明显升高，而血清中IL-17的表达水平明显降低，差异均有极显著统计学意义(P<0.01)；组间比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠IgE、IL-10及IL-17水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 四组豚鼠治疗后血清IgE、IL-10及IL-17水平比较

2.3 四组豚鼠治疗后鼻黏膜Foxp3和RORγt的相对表达量比较

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参，其表达相对值用各条带的灰度值与GAPDH比值表示。结果显示，治疗后，与空白组比较，模型组豚鼠鼻黏膜Foxp3蛋白表达明显降低，模型组豚鼠RORγt表达明显升高，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠鼻黏膜Foxp3表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而RORγt表达明显降低，差异有极显著统计学意义(P<0.01)。组间比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠Foxp3、RORγt表达量的差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图1。

表3 四组豚鼠治疗后鼻黏膜Foxp3和RORγt的相对表达量比较

图1 Western Blot检测豚鼠黏膜RORγt与Foxp3的表达

2.4 四组豚鼠鼻黏膜组织病理检查结果

光镜下豚鼠鼻黏膜病理检查结果显示，模型组豚鼠鼻黏膜上皮结构紊乱，黏膜水肿，组织间隙出血或伴血管扩张充血，间质中大量炎症细胞浸润明显；空白组豚鼠鼻黏膜上皮组织结构完整，未见挤压变形的炎症细胞等；治疗后，与模型组比较，氯雷他定片组、鼻敏片组豚鼠鼻黏膜炎症反应明显减轻，见图2。

A.模型组；B.氯雷他定片组(治疗后)；C.鼻敏片组(治疗后)；D.空白组A.model group; B.claritin group(after treatment); C.Bimin tablets group(after treatment); D.blank group

3 讨论

中医学认为，AR属“鼽嚏”“鼻鼽”范畴。《脏象》曰：“肺开窍于鼻，肺属金、肾属水、金水同源。”《医法圆通·鼻流清涕·卷一》曰：“鼻流清涕一证，有从外感而致者，有从内伤而致者，从外感而致者，感受外来之客邪，客于肺经，闭其清道，肺气不得下降，清涕是出……从内伤而得者，由心肺之阳不足，不能统摄津液，而清涕出，肾络通于肺，肾阳衰而阴寒内生，不能收束津液，而清涕亦出。”[12]认为本病是由肺脾肾三脏功能的虚损，风寒之邪气乘虚侵入而致的本虚标实证，肺气虚则卫表不固，腠理疏松，风寒之邪气乘虚侵入累及于鼻，邪气客于肌表，而使阳气壅滞于内无法泄越，故见喷嚏外出而为嚏；且寒邪之气壅肺，使其失于清肃，鼻窍不通故为鼽[13]。根据其病因病机特点，结合现代药理学成果，得到经验方鼻敏片，以益气固表、祛风散邪的玉屏风散配合温肺肾阳、祛散风寒的麻黄附子细辛汤，并加健脾摄津止涕的药物化裁而成，可标本同治。现代药理研究结果发现，麻黄中的槲皮素有消炎、抗过敏及抗病毒等作用，且可抑制免疫反应[14]；细辛挥发油的消炎、抗真菌及抗过敏等特性，可减轻AR的临床症状[15]；黄芪多糖可促进抗体生成以调节免疫[16]；白术多糖能活化T淋巴细胞以调节其免疫[17]；防风多糖在抑制黏膜的炎症反应方面收效显著，可调节免疫应答[18]。

既往研究结果表明，AR属IgE介导的Ⅰ型变态反应，其发病机制研究主要集中在Th1/Th2细胞失衡方面，认为其发病是因Th1/Th2细胞失衡而使Th2细胞的表达增多，从而表现出以嗜酸粒细胞浸润为主的炎症反应[19]。近年来，研究者发现其发病还与Th17、Treg的免疫失衡密切相关，进一步为AR的治疗机制研究提供了新的思路[20]。研究结果表明，Th17、Treg在CD4+T细胞的基础上进行分化，且在功能表现上相互制约，从而维持机体免疫状态的稳态[21-22]。其中，RORγt是Th17细胞独特的转录因子，Foxp3是Treg细胞的特异性转录因子，其表达可在一定程度上反映Th17、Treg细胞的功能变化和状态[23-24]。Th17细胞可分泌IL-17、IL-6、粒细胞集落刺激因子、趋化因子CXCL1、趋化因子CXCL5及基质金属蛋白酶等，使中性粒细胞、巨噬细胞不断聚集，进而导致炎症细胞发生浸润、组织遭受严重破坏，从而参与机体免疫的系统调控[25-26]。Treg细胞通过分泌IL-10、转化生长因子β等抑制炎症的因子，使得Th2细胞的活性降低，IgE的合成减少，并使嗜酸性粒细胞及细胞因子的募集、活化功能减弱，从而使其变态反应性炎症症状得到缓解[27]。

本研究结果显示，鼻敏片对于鼻部炎症所致黏膜水肿有着较为明显的疗效，且可降低血清中IgE的含量，减轻豚鼠喷嚏、流涕及抓鼻的鼻部症状，从而达到治疗AR豚鼠的目的。鼻敏片可显著升高血清IL-10水平，降低血清中IL-17的表达，从而纠正Th17/Treg细胞的失衡，缓解免疫炎症反应，其可能通过增强Foxp3蛋白的表达，抑制RORγt蛋白的表达，从而调节Th17/Treg细胞的失衡。