尿石素A改善高糖致血管内皮损伤的作用与机制

邓智琴，杨永健，2

（1.西南交通大学医学院，成都 610000；2.西部战区总医院心血管内科，成都 610083）

糖尿病是一种慢性进展性内分泌疾病，持续高糖及长期代谢紊乱可致血管病变［1］，而动脉粥样硬化的加速形成是血管病变的基础，其中血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生、发展的关键。研究表明，氧化应激是糖尿病血管并发症发生的重要致病机制［2］，高糖可造成活性氧簇的大量积累，超过内源性抗氧化酶的清除能力，形成氧化应激状态并损伤血管内皮细胞。因此，保护内皮细胞免受氧化应激损伤是防治糖尿病血管病变的关键途径［3］。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是参与细胞脂蛋白代谢的关键酶，与糖尿病患者的氧化应激、胰岛素抵抗和自噬等密切相关［4-5］，其失调在氧化应激诱导的血管内皮功能障碍中起关键作用［6-7］。尿石素A（uro⁃lithin A，UA）是人体摄入主要由富含鞣花单宁的食物（石榴、草莓、核桃等）经体内肠道代谢产生，除了在抗炎、诱导自噬方面发挥积极的生物功效［8-10］，其抗氧化作用在急性肾损伤［11］、心肌缺血再灌注损伤［9］、神经退行性疾病［12］等相关研究中也已明确证实，并且可以通过激活AMPK 发挥对阿尔兹海默病神经元的保护作用［13］。但UA 在糖尿病血管病变中的作用，以及其作用是否与AMPK/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路的激活有关暂无报道。为此，本研究通过高糖培养基处理人脐静脉内皮细胞株模拟高糖损伤，以研究UA 对高糖介导的氧化应激水平和血管内皮功能的影响，并初步探讨了其相关的机制，为糖尿病血管病变的防治提供新的理论依据和治疗药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

人脐静脉内皮细胞株CRL-2922EA.hy926 购于美国ATCC 细胞库；DMEM 低糖培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；D-（+）-葡萄糖溶液（美国Sigma 公司）；UA、Dorsomorphin（Compound C，Com C）dihydrochloride（美国Abmole 公司）；CCK8 检测试剂盒（索莱宝生物科技公司）；人细胞上清内皮素（endothelin-1，ET-1）酶联免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海酶联生物公司）；一氧化氮检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒及二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）荧光探针（上海碧云天生物科技公司）；细胞内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗体、AMPK抗体、p-eNOS（Ser1177）抗体及p-AMPK（Thr172）抗体（Affinity 公司）；GAPDH（武汉三鹰公司）。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养 内皮细胞用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基于37℃，5%二氧化碳恒温培养箱中进行培养。当细胞融合生长达到约90%，用0.25%胰酶消化按1∶2传代，取对数生长期细胞接种24 h 后换液，进行后续实验。

1.2.2 实验分组 为探讨不同浓度UA 对高糖下内皮细胞存活的影响，UA 干预做浓度梯度分别为（0.1、1、10、50 μmol）。实验分组处理如下：（1）正常对照组（normal glucose，NG：含5.5 mmol 葡萄糖DMEM 培养基）；（2）高糖对照组（high glucose，HG：含33 mmol 葡萄糖的高糖培养基）；（3）高糖+UA 组（HG+UA：高糖培养基+UA 10 μmol 孵育）；（4）高糖+UA+Compound C 组（HG+UA+Com C：高糖培养基+UA 10 μmol+Com C 1 μmol 孵育）；干预时间为24 h。

1.2.3 CCK8 检测细胞存活 96 孔板贴壁细胞干预完后，向每孔加入10 μL CCK8 溶液，将培养板在培养箱内孵育1～4 h，用酶标仪在450 nm 处测定吸光度，实验重复3次，计算并评价细胞相对存活。

1.2.4 细胞上清一氧化氮浓度检测 待细胞处理结束，培养基1 000g离心10 min取上清备用。96孔板中加入标准品和样品，与NADPH（2 mmol）、FAD和Nitrate Reductase 混匀后，37 ℃孵育30 min；加入乳酸脱氢酶缓冲液和乳酸脱氢酶混匀后，37 ℃孵育30 min；加入Griess Reagent I 和Griess ReagentⅡ混匀后，室温（20 ℃～30 ℃）孵育10 min 后立即用酶标仪在540 nm 波长处测定各孔的光密度值并分析数据。

1.2.5 细胞上清内皮素-1浓度检测 ET-1浓度采用酶联免疫吸附试验法检测，样品制备同1.2.4。将标准品和样品分别加入反应孔中，与亲和链酶素-HRP 混匀后在37℃温育60 min；洗板5 次；加入底物A、B 后37℃避光温育15 min；加入终止液后立即用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔的吸光度并分析数据。

1.2.6 二氢乙锭染色检测活性氧簇生成 细胞干预完后，以5 μmol 的DHE 染色液37 ℃避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液溶液洗涤，经荧光显微镜观察并拍照。

1.2.7 超氧化物歧化酶活性检测 实验结束后按照试剂盒说明书推荐的操作步骤收集细胞，氮蓝四唑（NBT）显色法测定SOD 活性（U/mL），37 ℃孵育30 min 后用酶标仪在波长560 nm 处测定各孔吸光度值并计算SOD 相对活性。

1.2.8 蛋白免疫印迹 细胞加入裂解液，提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。将30 μg 变性好的蛋白进行十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶，利用半干转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭1 h后，一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，二抗室温孵育1 h，TBST 缓冲液洗膜3 次，扫膜成像。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0 统计软件进行数据录入及统计分析，GraphPad Prism 6.0 软件制图。计量资料用（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿石素A 明显提高高糖诱导条件下内皮细胞存活

CCK8 实验结果显示，与正常对照组相比，高糖明显降低了细胞存活（P＜0.05），UA（1 μmol～10 μmol）呈剂量依赖性提高内皮细胞的存活。10 μmol 和50 μmol 无明显差异（P＞0.05）（图1），后续实验UA 干预浓度取10 μmol。

图1 不同干预分组下内皮细胞存活比较（HG：高糖培养基处理；UA：处理高糖组与正常组相比，aP＜0.05；UA 处理组与高糖组相比，bP＜0.05，ns：P＞0.05）

2.2 尿石素A 改善高糖环境所致血管内皮功能障碍

通过检测各组内皮细胞分泌NO 和ET-1 的分泌量，我们评估了UA 对高糖环境下血管内皮功能的影响。与正常对照组比较，高糖明显降低NO 的分泌量（P＜0.05），提高ET-1 的分泌量（P＜0.05）；加入UA（10 μmol）后，NO 的分泌量明显升高（P＜0.05），ET-1 的分泌量降低（P＜0.05）。而UA 的调节作用在同时给予AMPK 的抑制剂后消失（图2）。

2.3 尿石素A 降低高糖诱导血管内皮细胞的氧化应激水平

从DHE 荧光染色［检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成］结果及荧光定量分析和SOD活性结果来看，与正常对照组比较，高糖环境使血管内皮细胞ROS 水平显著升高，SOD 活性降低（P＜0.05）；UA孵育明显减少ROS的水平和增加SOD活性（P＜0.05）；上述作用在同时给予AMPK 的抑制剂Com C后明显减弱（P＜0.05）（图3）。

图2 UA对内皮细胞分泌NO和ET-1的影响（A：内皮细胞上清NO 浓度，B：内皮细胞上清ET-1 浓度）注：HG 组与NG 组相比，aP＜0.05；HG+UA 组与HG 组相比，bP＜0.05；HG+UA+Com C 组与HG+UA 组相比，cP＜0.05

2.4 尿石素A 激活AMPK/eNOS 通路改善高糖所致内皮细胞损伤

在进一步的机制探讨中，我们通过蛋白免疫印迹检测UA 对AMPK/eNOS 信号通路的影响，相应蛋白磷酸化水平由p-AMPK/AMPK、p-eNOS/eNOS体现。结果显示与正常组比较，高糖干预的内皮细胞中AMPK、eNOS 磷酸化水平明显降低（P＜0.05）；UA 则可以有效逆转AMPK、eNOS 磷酸化水平改变（P＜0.05）；但该作用可被AMPK 的抑制剂所拮抗（P＜0.05），见图4。以上结果表明，UA 可能通过激活AMPK/eNOS 通路改善高糖诱导的内皮细胞损伤。

3 讨论

近年来，我国糖尿病发病率逐年上升，糖尿病诱发的血管病变严重危害着糖尿病患者后期的生存质量。糖尿病的发生伴有糖脂代谢紊乱，而血糖的增高和游离脂肪酸的增多均可损伤血管内皮细胞。因此，保护内皮细胞免受高糖损伤至关重要。

图3 各组内皮细胞ROS 水平及SOD 活性比较（A：DHE 荧光染色，×400；B：相对荧光强度定量；C：SOD 相对活性）注：HG 组与NG组相比，aP＜0.05；HG+UA 组与HG 组相比，bP＜0.05；HG+UA+Com C 组与HG+UA 组相比，cP＜0.05

高糖环境下，内皮细胞线粒体膜电位震荡，NADPH 氧化酶活性增高，生成大量的ROS，破坏线粒体，使其功能严重失调，加剧氧化应激状态。血管内皮细胞能分泌多种活性物质来发挥舒缩血管、调节血管通透性、抗凝抗血栓等重要功能［14-15］，其中NO 具有舒张血管、抗血小板聚集的作用；ET-1具有收缩血管，促血小板黏附的作用，是内皮依赖性血管舒缩作用的关键调节因子。生理情况下，NO 与ET-1 处于动态平衡水平，维持血管张力。在高糖环境下，其平衡被打破，ET-1 可以通过激活ETA/ETB 受体，增加内皮细胞氧自由基的生成［16］，内皮细胞进一步损伤，引发血管病变。

AMPK 在许多信号通路的占核心地位［17-18］，在内皮细胞中，AMPK/eNOS通路的激活，通过Ser1177位点激活eNOS 磷酸化，增加NO 的释放量，提高内皮细胞功能［19-20］，还通过拮抗ET-1 浓度升高导致的氧化应激，发挥保护作用。此外，已经研发用于治疗2 型糖尿病的药品，如二甲双胍［21］，噻唑烷二酮（TZD）［22］和胰高血糖素样肽-1 受体激动剂［23］，均能激活AMPK，证明可用于预防糖耐量降低，延缓2 型糖尿病的进展。

UA 是经肠道菌群代谢生成的一类具有不同酚轻基的二苯并喃-6-酮衍生物，具有较高的生物利用度，对于多种疾病模型发挥积极的生物功效。Ryu 等［24］报道，UA 通过诱导线粒体自噬改善线粒体蛋白稳态，口服UA 可以延长线虫寿命和改善小鼠骨骼肌功能。石榴汁可改善患有冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者应激诱导的心肌缺血［25］并抑制巨噬细胞胆固醇和氧化脂质的积聚，减缓动脉粥样硬化进展以及控制其随后的心血管事件的发生［26］。最新研究证实，UA 可以直接清除自由基，保护Neuro-2a（神经-2a）细胞免于氧化应激损伤，发挥氧化酶抑制剂的效果，清除氧自由基，明显改善抗氧化酶（SOD、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶等）的活性［22］，提示UA在对抗氧化应激方面有非常大的潜在价值。UA可以通过激活AMPK信号蛋白，促进髓核（NP）细胞线粒体自噬，抑制凋亡，减弱椎间盘退行性变［27］；在阿尔兹海默病模型中，通过增强脑神经元AMPK激活，产生抗炎和神经元保护作用，改善认知能力［13］。

以上研究表明，UA 具有抗氧化应激的活性，且其发挥生物功效与AMPK 的激活相关联，但其在糖尿病血管病变中的作用，以及其作用是否与AMPK的激活有关，国内外目前无相关的报道。

本研究证实，UA 可显著减轻高糖介导的血管内皮细胞ROS 水平的升高，促进eNOS 的磷酸化，通过维持NO/ET-1 的平衡而对血管舒缩、血小板聚集等生理活动具有调节作用，对抗高糖致内皮细胞的损伤；上述UA 的所有保护作用几乎都被AMPK 的抑制剂Com C 所消除，提示UA 的保护作用可能通过激活AMPK/eNOS 通路，上调其磷酸化有关。

综上所述，UA 能够抑制高糖介导的氧化应激，改善血管内皮功能障碍，显著拮抗高糖介导的血管内皮损伤，有望成为糖尿病血管并发症的防治提供新的干预手段，亦可为日后的相关研究提供思路。