ODN2088减轻线粒体DNA致脓毒症大鼠急性肺损伤

唐甜，李少军，郭鹏飞，杨林，敖晓晓，胡兰，谭利平

(重庆医科大学附属儿童医院，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地，儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

脓毒症是严重创伤、感染、休克等重症患者常见的并发症，也是急诊科及重症监护室死亡事件的主要病因之一[1-2]。呼吸道、胃肠道和泌尿道感染是导致脓毒症常见的感染源[3]，而急性肺损伤(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征是脓毒症引起多器官功能衰竭中常见的并发症[4]。目前脓毒症相关ALI除支持治疗外，仍无其他有效防治措施[5]。因此，从分子水平研究脓毒症相关ALI发病机制，为其防治提供新的方向具有重要意义。脓毒症及其相关ALI是由细菌、病毒、真菌等感染与机体免疫系统相互作用介导的全身炎症反应，称为“细胞因子风暴”[6]。近年来有研究发现，脓毒症感染时线粒体功能障碍、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)向细胞质及细胞外移位促发炎症反应导致ALI甚至死亡[7]。

线粒体作为细胞内的双膜包被细胞器，不仅与组织能量代谢、细胞程序性死亡有关，还涉及全身炎症反应[8]。脓毒症感染时大量活性氧破坏线粒体膜并释放mtDNA到细胞质中[9]，细胞凋亡和血小板激活促进mtDNA释放到细胞外导致血浆mtDNA水平升高[10-11]。mtDNA是激活免疫系统促进人体炎症反应的激动剂[10]，血浆mtDNA水平是评估脓毒症患者预后及病死率的重要生物学指标[12-13]。内共生学提出，线粒体与细菌有同源性，有相同的双膜结构且DNA中含有大量非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤核苷酸序列(即CpG基序)。机体通过TLR9受体识别细菌细胞核DNA中CpG基序，因mtDNA具有相似的免疫源性而促发免疫反应[14-15]。所以，细菌DNA和mtDNA均能通过TLR9受体激活p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路诱发炎症反应[16]。脓毒症感染时坏死组织释放线粒体碎片及mtDNA激活中性粒细胞TLR9/p38 MAPK信号通路，导致基质金属蛋白酶8(matrix etallo-proteinase，MMP-8)、MMP-9、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在肝脏累积[17]。因而，靶向作用于TLR9受体，抑制p38受体激活可减轻肺血管通透性和炎症反应并改善肺功能[18-19]。有研究发现，内毒素诱导的脓毒症小鼠模型血浆mtDNA水平升高，正常小鼠腹腔注射mtDNA出现ALI与TLR9/p38 MAPK通路激活促进炎症因子释放有关[20]。

本研究采用盲肠结扎穿孔手术(cecal ligation and perforation，CLP)建立脓毒症大鼠模型[21]，探讨大鼠mtDNA在脓毒症ALI中的作用及TLR9受体抑制剂ODN2088对脓毒症ALI的影响，为脓毒症及相关ALI的预防及治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6～8周SD雄性大鼠，体质量210～220 g，均购自重庆医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(渝)2012-0001。

1.2 试剂

提取血DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；提取组织和细胞线粒体试剂盒(美国Biovision公司)；提取血微量DNA试剂盒(德国QIAGEN公司)；RNA提取及荧光定量PCR(QPCR)试剂(TaKaRa公司)；BCA蛋白检测试剂(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠mtDNA提取 在无菌条件下分离大鼠肝脏组织，按照试剂盒说明书提取线粒体及mtDNA。用紫外线分光光度计检测mtDNA浓度A(260)/A(280)为1.8～2.0。QPCR检测核DNA占mtDNA总量少于0.1%，除外核DNA污染。

1.3.2 动物分组和建立脓毒症合并ALI大鼠模型 随机数表法将80只大鼠分为假手术(sham)组、脓毒症(sepsis)组、脓毒症大鼠腹腔注射1.4 mg/kg mtDNA(sepsis+mtDNA)组、脓毒症大鼠腹腔注射1.4 mg/kg mtDNA和1 mg/kg ODN2088(sepsis+mtDNA+ODN)组。参考文献[22]采用盲肠结扎穿孔法(CLP)方法制备脓毒症合并ALI大鼠模型：大鼠麻醉并备皮消毒，沿前腹正中线做切口游离盲肠，丝线应避开肠系膜血管结扎距盲肠末端1.5 cm处，针头2次贯穿盲肠并挤出少许肠内容物后还纳腹腔。术后大鼠放回笼内自由进食、饮水。

1.3.3 提取血浆DNA 提取大鼠术后6、12 h血浆。将50 μL血浆与等量磷酸盐缓冲液混匀，在4 ℃条件下以16 100 g离心15 min，取90 μL上清液。根据血微量DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并溶于200 μL溶解液。

1.3.4 荧光定量PCR测定mtDNA水平 细胞色素B(cytochrome B，cytB)为大鼠mtDNA标志基因。线粒体cytB引物序列：上游引物5’-TCCACTTCATCCTCCCATTC-3’，下游引物5’-CTGCGTCGGAGTTTAATCCT-3’。按10倍梯度稀释携带大鼠mtDNA质粒并制备标准曲线，通过标准的转换系统(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)将mtDNA浓度转换为拷贝数(copies/μL)。血浆mtDNA浓度的计算公式：

c=Q×VDNA/VPCR×1/VEXT

c为血浆中mtDNA拷贝数；VDNA为提取血浆DNA溶于溶解液体积，本实验为200 μL；VPCR为荧光定量PCR时DNA体积，本实验为0.8 μL；VEXT为提取血浆DNA的血浆体积，本研究为50 μL。

1.3.5 实时PCR检测大鼠肺组织TLR9/p38 mRNA水平 根据TRIzol液说明书提取50 mg肺组织总RNA，逆转录合成cDNA。以磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)为内参。目的基因：TLR9上游引物5’-TCCGTGACAATCACCTCTCTT-3’，下游引物5’-GGTCCAGGTCTCGCAGATT-3’；p38上游引物 5’-AGTGGCTGACCCTTATGAC-3’，下游引物5’-CACAGTGAAGTGGGATGGA-3’。按2-△△Ct方法计算并统计分析实验结果。

1.3.6 评估肺损伤程度 将肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，各肺组织标本在400倍光镜下随机选择20个视野对肺损伤程度行量化评分[23]。评分内容包括肺泡腔中性粒细胞计数、肺间质中性粒细胞计数、透明膜、肺泡腔蛋白碎片及肺泡间隔厚度，肺损伤程度分为0、1、2分。取5项指标评分之和，总分为0～1分，评分越高，越严重。

1.3.7 测肺水含量 用滤纸吸干肺组织多余水分，称湿质量(W)。恒温电热干燥箱70 ℃烘干72 h后称干质量(D)，计算肺组织水含量为(W-D)/D值。

1.3.8 测定肺泡灌洗液蛋白量和WBC 大鼠处死后分离气管及主支气管行气管插管，共收集4次右肺肺泡灌洗液，均用3 mL PBS缓冲液灌洗，离心后测定肺泡灌洗液上清液蛋白含量，细胞沉淀重悬在1 mL PBS缓冲液中，取20 μL与180 μL 0.1%的稀盐酸混匀，测得WBC。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 脓毒症合并ALI大鼠临床表现

本研究建立脓毒症合并ALI模型，1周病死率达到60%，符合中度脓毒症标准[24]。因脓毒症模型大鼠病死率较高，本研究仅监测大鼠CLP术后12 h内炎症表现和病死率。本研究发现，sepsis+mtDNA组较sepsis组大鼠病死率更高，脓毒症症状更严重，如竖毛、弓背、发绀、拒食、嗜睡和气促。然而，sepsis+mtDNA+ODN组大鼠较sepsis+mtDNA大鼠病死率及脓毒症症状明显减轻。CCP术后大鼠生存曲线见图1。

图1 CLP术后大鼠生存曲线

2.2 血浆mtDNA水平与脓毒症严重程度的关系

4组大鼠血浆mtDNA水平12 h较6 h升高(P<0.05)。sepsis组大鼠血浆mtDNA水平较sham组升高(P<0.05)，sepsis+mtDNA组较sepsis组血浆mtDNA水平进一步升高(P<0.05)。sepsis+mtDNA+ODN组大鼠血浆mtDNA水平较sepsis+mtDNA组降低(P<0.05)。见图2。

注：*与sham组比较，P<0.05；#与sepsis组比较，P<0.05；&与sepsis+mtDNA组比较，P<0.05

2.3 mtDNA加重脓毒症相关ALI

2.3.1 肺组织病理改变 Sepsis组较sham组大鼠肺泡间隔增宽、塌陷，肺泡间质水肿，肺泡腔及肺泡间隔可见少量中性粒细胞和红细胞渗出。sepsis+mtDNA组大鼠肺泡结构破坏严重，肺泡间隔增宽较sepsis组更严重，支气管壁、肺泡间隔、肺泡腔见大量中性粒细胞浸润，肺血管扩张明显，证实腹腔注射mtDNA加重脓毒症大鼠ALI。然而，sepsis+mtDNA+ODN组大鼠肺组织较sepsis+mtDNA组肺泡结构破坏、肺泡间隔增宽、支气管壁、肺泡间隔、肺泡腔中性粒细胞浸润、肺血管扩张病理改变明显减轻，证实ODN预处理可减轻腹腔注射mtDNA对脓毒症大鼠ALI的作用。见图3。

图3 4组大鼠肺组织病理学改变

2.3.2 肺组织病理评分 与sham组和sespsis组大鼠比较，sepsis+mtDNA组大鼠的ALI评分更高，且肺泡中性粒细胞浸润、透明膜形成、肺泡间质增宽更严重。然而，sepsis+mtDNA+ODN组较sepsis+mtDNA组大鼠的ALI评分显著下降。总体而言，各组大鼠ALI评分12 h较6 h时均有上升。见表1。

表1 4组大鼠肺组织病理评分比较 分

2.3.3 肺组织炎症反应 大鼠肺泡灌洗液WBC sepsis+mtDNA组较sham组和sepsis组升高(P<0.05)，sepsis+mtDNA+ODN组较sepsis+mtDNA组大鼠肺泡灌洗液WBC减少(P<0.05)，证实腹腔注射mtDNA可诱导肺组织炎性细胞的分泌和浸润，而ODN预处理可减轻mtDNA诱导的肺组织炎症反应。见图4。

注：*与sham组比较，P<0.05；#与sepsis组比较，P<0.05；&与sepsis+mtDNA组比较，P<0.05

2.3.4 肺毛细血管通透性 Sepsis+mtDNA组较sham组和sepsis组大鼠肺毛细血管通透性增加，即肺水和肺泡灌洗液蛋白含量增高(P<0.05)。而ODN预处理使sepsis+mtDNA+ODN组较sepsis+mtDNA组大鼠肺毛细血管通透性下降(P<0.05)。见图5、图6。

注：*与sham组比较，P<0.05；#与sepsis组比较，P<0.05；&与sepsis+mtDNA组比较，P<0.05

注：*与sham组比较，P<0.05；#与sepsis组比较，P<0.05；&与sepsis+mtDNA组比较，P<0.05

2.4 mtDNA激活肺组织TLR9/38 MAPK通路

sepsis组较sham组大鼠TLR9/p38 MAPK信号通路激活(P<0.05)。sepsis+mtDNA组较sepsis组TLR9/p38 MAPK信号通路表达进一步升高(P<0.05)。与sepsis+mtDNA组比较，ODN预处理可抑制sepsis+mtDNA+ODN组大鼠肺组织TLR9/p38 MAPK信号通路激活(P<0.05)。见图7、图8。

注：*与sham组比较，P<0.05；#与sepsis组比较，P<0.05；&与sepsis+mtDNA组比较，P<0.05

3 讨论

本研究分析大鼠血浆mtDNA水平与脓毒症及相关ALI的关系，并探讨TLR9受体阻滞剂ODN2088对mtDNA所致脓毒症相关ALI的抑制作用。本研究结果显示：(1)CLP所致大鼠脓毒症与既往研究结果一致[21]；(2)脓毒症及相关ALI严重程度与血浆mtDNA水平升高有关；(3)腹腔注射mtDNA加重脓毒症大鼠ALI；(4)TLR9选择性抑制剂ODN2088减轻脓毒症及相关ALI。本研究证实血浆mtDNA水平可预测脓毒症严重程度，且TLR9抑制剂可减轻脓毒症所致ALI。

注：*与sham组比较，P<0.05；#与sepsis组比较，P<0.05；&与sepsis+mtDNA组比较，P<0.05

mtDNA与细菌和病毒DNA含有相同的CpG基序，可被表达在树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞等免疫细胞的TLR9受体识别激活、促进促炎细胞因子释放[25-26]。此外，脓毒症早期病理过程即存在线粒体损伤和功能障碍，导致细胞凋亡并释放mtDNA到细胞外[11]。因此，mtDNA作为一种内源性损伤分子，同脓毒症及相关ALI和病死率密切相关[27]。用脂多糖建立小鼠脓毒症模型腹腔注射mtDNA使血浆mtDNA水平显著升高，并与脓毒症严重程度相关[20]。此外，脓毒症患者血浆mtDNA水平较对照组明显升高，表明血浆mtDNA可能成为危重患者预测病死率的重要参考指标[28-29]。本研究进一步证实，脓毒症大鼠血浆mtDNA水平升高，腹腔注射mtDNA可增加脓毒症大鼠血浆mtDNA水平及病死率。

此外，mtDNA诱导TLR9和p38受体激活对促炎细胞因子释放、中性粒细胞内流和肺组织血管通透性增加至关重要[30-32]。有研究发现，mtDNA可激活中性粒细胞TLR9/p38 MAPK信号通路促进炎症因子释放，增加钙通道和MAPK磷酸化提高内皮细胞通透性[17]。同时，气管内或静脉注射mtDNA均可激活TLR9/p38 MAPK通路加重肺组织炎症反应[20，33]。因此，TLR9受体在mtDNA介导的肺部炎症及损伤中具有重要意义。本研究采用CLP建立大鼠脓毒症模型，探讨mtDNA在脓毒症所致ALI的作用，发现血浆mtDNA可促进肺组织TLR9/p38 MAPK受体表达。然而，TLR9受体阻滞剂ODN2088预处理大鼠，在降低血浆mtDNA水平同时，可抑制肺组织TLR9/p38 MAPK受体表达并减轻ALI。

综上所述，本研究发现mtDNA在脓毒症及相关ALI中的作用以及TLR9受体阻滞剂减轻mtDNA所致肺损伤。进一步检测脓毒症患儿血浆mtDNA水平动态变化以及TLR9受体阻滞剂在脓毒症患者中的临床应用，为脓毒症的诊断、治疗提供新的方向。