嗜酸乳杆菌上清液制备及其对PC12细胞增殖的影响

＊彭友 魏佳旭 衣爽 祖继宏 赵雨竹

（吉林农业科技学院 吉林 132101）

中枢神经系统退行性疾病目前常用的治疗方法主要包括药物、外科手术和细胞移植，然而这些方法效果并不理想，常伴有一定的副作用。近年来，研究发现肠道菌群组成和数量的改变对中枢神经系统疾病的预防和治疗有着重要的作用，同时人体自身也能够通过相应的组织和器官对肠道的菌群进行调节，从而使肠道微生态达到平衡。嗜酸乳杆菌是益生菌中具有代表性的菌种之一，其在肠道、阴道、口腔等器官定殖。研究发现益生菌具有抗肿瘤，调节免疫等有益功效，补充益生菌还可以积极改善抑郁症或焦虑等症状，因此这类细菌也被称作精神性微生物。目前关于肠道细菌和中枢神经系统之间的相互影响已有许多研究基础，但对肠道菌群与神经类细胞之间的研究较少。因此，本实验通过获取嗜酸乳杆菌培养上清液来研究其对体外培养PC12细胞增殖的影响。

1.实验方法和实验材料

(1)实验材料

RPMI1640细胞培养基，胎牛血清，PC12细胞株，嗜酸乳杆菌冻干菌体（保藏编号：ATCC 4356），MRS培养基，Cell Counting Kit 8（CCK-8）试剂盒。

(2)实验方法

①嗜酸乳杆菌的培养。准备蒸馏水100mL，同时准备MRS粉末，用电子天平称取6.62g。将称好的粉末放入蒸馏水中溶解。随后对液体进行高压灭菌处理，时间15min，恢复常温后得到MRS液体培养基，随后利用其进行冻干菌体的复苏，在轻微振荡后将其溶解，溶解后进行分装。置于37℃培养箱内24h。次日，准备MRS液体培养基，取部分复苏后的嗜酸乳杆菌加入到其中，置于37℃培养箱内24h，连续两次分离培养。

②生长曲线测定。当嗜酸乳杆菌的种子液OD600值为1时，以3%体积比将其加入100mLMRS液体培养基中。在37℃环境下静置培养。每间隔2h要进行取样，每次取样设置三个平行组，测量在600nm波长下的吸光值。随后进行生长曲线的绘制，纵坐标为OD600的值，时间是横坐标。

③嗜酸乳杆菌上清液的制备。准备MRS液体培养基，体积为100mL，向其中加入嗜酸乳杆菌种子液，体积比为3%，随后进行静置培养，温度为37℃，时间为28h。培养后对其进行离心，时间为15min，转数为8000r/min，离心后保留上清液将沉淀除去，随后过滤，先后利用0.45μm和0.22μm孔径的滤膜。把滤出的液体加到准备好的MRS培养基中进行观察，时间为一个星期，如果培养基上没有出现细菌生长繁殖的情况，就可以对其进行保存备用，保存温度为4℃。

④细胞形态学影响。PC12细胞悬液密度进行调整至5×104cells/mL后接入96孔板，以100μL/孔培养。在经过12h后将获取的上清液分别以体积分数2%、4%、6%加入孔板中继续进行培养，同时设置不加上清液的对照组，每组设置三个平行组。2d后在显微观察生长情况并拍照记录。

⑤细胞增殖影响。重复1.2.4的方法培养2d后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，将96孔板放在培养箱培养4h。后用酶标仪测450nm处吸光度值，计算存活率。细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

2.结果与分析

(1)嗜酸乳杆菌的生长曲线

如图1所示，嗜酸乳杆菌培养一共分为四个阶段，其中0-7h处于迟缓期，7-20h为对数生长期，20-30h为稳定期，30h后是衰亡期。因此，本实验所需上清液从培养时间28h左右的细菌液体培养基中获取。

图1 嗜酸乳杆菌的生长曲线

(2)L.a.s对PC12细胞的形态学影响

如图2所示，发现细胞贴壁生长，此时为培养2d后的PC12细胞生长情况，且随着上清液浓度增加，细胞密度也随之增加，细胞形态没有显著变化。

图2 PC12形态学图片

(3)L.a.s对PC12细胞的增殖影响

如图3所示，通过利用CCK-8法，发现随着L.a.s体积分数的增加，细胞存活率也随之增加。其中，6%L.a.s处理组能够使得细胞存活率发生很大变化。其主要表现为提升细胞的存活率，并且能够提升至对照组的131.31±4.59%。

图3 不同体积分数L.a.s对PC12增殖情况

(4)L.a.s对PC12细胞荧光染色结果

如图4所示，利用荧光显微镜观察PC12细胞的染色情况。A为对照组，B、C、D组分别对应为不同体积分数的L.a.s处理组，相比于对照组，C1、C2和D1、D2组细胞数量更多，染色结果与显微镜下的观察一致，说明细胞状态正常。

图4 PC12染色荧光图片

3.结论

通过将培养时间为28h的L.a.s按不同体积分数作用于PC12细胞，荧光染色和CCK-8细胞增殖检测结果表明，PC12细胞能够正常生长。而6%L.a.s处理组能够将PC12细胞的存活率提高至未处理组的131.31±4.59%，说明一定浓度下的L.a.s具有促进PC12细胞的作用。本研究并未对上清液中的具体有效成分进行分析，后续可以考虑对其进行详细分析，筛选出对PC12细胞增殖促进的主要成分，为进一步研究其神经保护作用打下基础。