浅谈高效液相色谱法分析条件的选择及在检验领域的应用与发展

（石家庄医学高等专科学校 河北 050000）

高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱的基础上引入气相色谱法的塔板理论和速率理论，逐步发展起来的一种分离分析方法。高效液相色谱法最大的优势是分离混合物中各种组分，相较于经典液相色谱法，HPLC中加入了高压泵，而且固定相颗粒比经典液相色谱法固定相颗粒直径要小且均匀，从而提高了分离分析的速度，通常分离分析仅需要几分钟到几十分钟。相较于气相色谱法来说，高效液相色谱法可用于热不稳定物质的分离分析。由于分离分析速度快，分离效果好等优点，在农业、医学、工业、检验等各领域，高效液相色谱法都有着十分广泛的应用。

1.高效液相色谱法测定条件的选择

HPLC在分离混合物时，如何选择色谱条件，决定着分离效果。HPLC色谱分离条件的选择主要以塔板理论和速率理论作为指导，包括色谱柱规格的选择、固定相和流动相的选择、柱温的控制、流动相流速控制等。

(1)色谱柱规格的选择

色谱柱规格主要包括柱长，柱内径以及固定相颗粒直径。

高效液相色谱柱柱内径的规格有2.1mm、3mm、4.6mm等，但目前最常用的是4.6mm。其它条件相同情况下，色谱柱内径越大，能分离样品的量越大，得到的峰形越好，对高效液相色谱仪器中的死体积敏感性越低，柱效相对也会高一些，但内径越大，在相同流速下，会消耗更多的溶剂。

综上所述，在色谱柱规格选择上，要进行综合考量。

(2)固定相和流动相的选择

固定相和流动相选择合理，才能使混合物中各组分得到较好的分离效果。

①固定相的选择

在液-固色谱法中，现在应用最广泛的固定相有硅胶、活性炭等，硅胶同时还可用于液-液分配色谱法中的载体和键合相色谱中的基体。近年来，键合相色谱法应用较多，因为这种方法可减少固定液的流失，分离效果好，适用范围广。弱极性脂溶性成分一般用正相键合相色谱，而弱极性、中等极性和较强极性的物质一般采用反相键合相色谱，可见反相键合相色谱应用范围更广一些。在反相键合相色谱中固定相常用的是C18，即把十八个碳原子的烷烃通过反应键合到硅胶上，固定相颗粒分为全多孔型和表面多孔型（薄壳型微珠）。相对分子量超过2000的高分子化合物如蛋白质、核酸和聚合物等可以采用凝胶色谱法，在这种方法中，应用最多的固定相是葡聚糖凝胶。当被分离的物质为离子或者可解离的化合物，可以采用离子交换色谱法，这种方法的固定相普遍使用的是键合型离子交换剂。

②流动相的选择

高效液相色谱法流动相可以是一种溶剂组成，也可以是两种或两种以上溶剂组成。常见流动相有水、甲醇、乙腈、四氢呋喃，这几种溶剂为极性溶剂，常用于反相色谱中。在正相色谱中，普遍使用的流动相有正己烷、乙醚、乙酸乙酯等。在实际应用中，常常把几种溶剂按照合适的比例混合在一起，溶剂成分和比例不同，极性也不同，对被测物的溶解能力不同，分离的效果自然也会不同，出峰时间也会相应发生变化。流动相对于被分离的物质必须要有合适的极性和选择性。

反相色谱中，流动相的pH值影响组分的保留时间，同时也会影响色谱峰的峰形以及分离度。分离弱酸性样品时，常加入少量的弱酸，抑制样品的解离，反之分离弱碱性样品时，常加入少量的弱碱，抑制弱碱样品的解离，以获得良好的峰形。

(3)柱温的控制

高效液相色谱法中，一般情况下，提高柱温，可以影响分离度，降低保留时间，提高柱效，增大样品的溶解度，使得色谱峰更加对称，但过高的柱温会使得流动相产生气泡。柱温的控制要根据样品组分的性质而定，如对于黏度大或高分子化合物，设置柱温时要高于室温，对于具有生物活性的生物分子，温度过高会使其失去生物活性，所以柱温要设置为低于室温。

(4)流动相流速控制

根据范第姆特方程，流动相的流速会对色谱柱的柱效和组分的保留时间有一定的影响，在一定范围内，流速越大，柱效会提高，分析时间会缩短，但超过某一流速值，柱效就会降低，这个流速值称为最佳流速。其它条件相同的前提下，色谱柱内径不同，设定的流速也应当不同，比如当内径是4.6mm时，通常将流速设定为1mL/min。

(5)检测器的选择

高效液相色谱法的检测器分为示差折光检测器、紫外吸收检测器、光电二极管阵列检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器等。不同的检测器都有相应的优势和缺陷，要根据被测物的种类、被测物含量以及流动相对测定是否有影响等因素，选择合适检测器。

如光电二极管阵列检测器可以全波段扫描，能得到三维立体图谱，而紫外吸收检测器只能用设定的波长对被分离后的组分进行扫描。示差折光检测器常用于萜类化合物、多糖类化合物含量的测定，但不能采用梯度洗脱。荧光检测器适用于能显示荧光的被测物含量检测，常用于生化分析和药物分析中，这种检测器的灵敏度很高，痕量组分检测就可以考虑选择荧光检测器，如PM2.5中苯并[a]芘含量的测定。

2.高效液相色谱法在检验领域中的应用与发展

高效液相色谱法广泛应用于药物检验、食品检验、生物化学检验、临床检验等领域，例如通过检验生物体内的多肽和蛋白质含量，可分析出生物体内的多肽和蛋白质的变化情况。食品检验中可以检测防腐剂、黄曲霉素、瘦肉精等含量。临床检验中，高效液相色谱法可以检测体内氨基酸、胆汁酸、核酸、多种同工酶。

高效液相色谱法最大优势在于分离混合物中物理性质和化学性质相近的组分。但高效液相色谱法在定性分析和定量分析中有一定局限性，比如要有参照物或者标准样品，用紫外吸收检测器在最大波长处可能会受干扰，灵敏度低等因素，所以高效液相色谱法经常与其它检验方法一起使用，比如质谱法。用高效液相色谱法对混合物进行分离，分离后各组分的含量用质谱法进行分析测定，质谱法灵敏度高，检测下限低，而且能够提供相对分子量和结构等信息，充分发挥了两种测定方法的优势，是近几年来被广泛应用的一种分析方法。

3.小结

综上所述，在采用高效液相色谱法时，为保证良好的分离效果，需要通过综合考量和实验验证，最终确定最优的测定条件。由于高效液相色谱法在定性分析和定量分析的限制性，高效液相色谱法常常与质谱法联合应用，从而扩大了检测范围。今后，高效液相色谱法还可以通过与其它检验方法的联合使用，进一步扩大检测范围，在检验领域发挥更大的作用。