循环肿瘤细胞在胰腺癌诊疗中的研究进展

曾 恒，胡尊琪 综述 冯 丹 审校

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，位居全球恶性肿瘤致死率第四位[1]。由于其缺乏特异性早期症状和体征，肿瘤灶进展迅速且较早发生局部浸润和转移，PC诊疗效果较差。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)定义为由肿瘤原发或转移灶自发脱落或因诊疗操作导致落入外周血液循环的肿瘤细胞[2]；CTCs在计数、表型变化上与肿瘤灶的状态密切相关，众多研究表明正是由于具有干细胞特性的CTCs从肿瘤灶脱落入血液系统而造成肿瘤的远处转移，因此外周血中存留的CTCs在恶性肿瘤的早期诊断、监测疗效、评估预后及指导治疗上有重要价值。

1 循环肿瘤细胞的检测技术进展

CTCs由肿瘤灶释放入外周血后以单个或聚集成团的形式存在，由于细胞微环境的改变，由于失巢凋亡、流体剪切力、免疫细胞杀伤等因素的影响，绝大部分细胞生存期很短，最终在外周血中存活的细胞极少，每毫升外周血仅含1～102个CTCs[3]，因此对检测技术要求极高。

1.1 物理学特征富集法 密度梯度离心法主要基于血液中各种细胞的密度不同，利用分离介质及高速离心分离肿瘤细胞，该方法不受细胞表面标志物的影响，可获得较高检出率，但富集的CTCs纯度较低且活性较弱。膜滤过法主要利用肿瘤细胞尺寸大于非肿瘤细胞的物理学特性分离，大多数研究认为，滤过膜滤孔直径在8 μm时可获得最好滤过效果，该方法能较好地保持肿瘤细胞形态及活性，但并非所有肿瘤细胞直径均大于8 μm且其他细胞直径均小于8 μm，因此该方法的劣势在于富集的CTCs纯度不够[4]。

1.2 免疫学特性富集法 (1)免疫磁珠法是利用特异性单克隆抗体标记的磁珠结合肿瘤细胞表面的特异性抗原来识别CTCs，利用外加磁场吸附抗原-抗体复合物从而富集CTCs，最常选用的抗原为上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)[5]，这是因为绝大部分肿瘤细胞上皮表达EpCAM而非肿瘤细胞基本不表达。目前唯一通过美国FDA批准的Cellsearch系统即是利用偶连有EpCAM抗体的磁珠捕获CTCs。但部分CTCs由于发生上皮-间充质转化导致细胞表面不再表达EpCAM等上皮型标志物，因此该方法的缺点是CTCs的受检率较低。(2)微流控芯片是利用外周血在芯片中流动时通道表面抗体发生抗原-抗体反应捕获CTCs， 该种检测方法整个富集流程高度自动化，且富集的CTCs能保持较高活性[6]，但依然难以避免因EpCAM下调导致的受检率较低的问题。

1.3 物理学、免疫学特性结合法富集 Chen等[7]开发了一种将基于尺寸微孔滤过的物理法和免疫法结合的微流控制装置，成功提高了CTCs的捕获效率，高达87.2%～93.5%。Su等[8]融合细胞尺寸大小和表面特异性抗原特性设计出一种“过滤芯片”，利用表面涂有氧化锌纳米结构微球提高CTCs捕获效率，再通过“过滤芯片”捕获、分离、检测CTCs,这种具有抗体功能微球集成芯片使得CTCs检出率高达90%以上，具有广泛的应用前景。

2 循环肿瘤细胞在PC诊疗中的应用

超过80%的PC在确诊时已处于中晚期，根治性手术切除率低，且术后复发率极高。有学者认为，PC致死率居高不下的原因有以下几点；(1)胰腺解剖位置隐匿，症状不典型，早期诊断困难，即发生转移和全身恶病质的表现[9]。(2)对放疗、化疗不敏感，目前缺乏有效的非手术治疗方法。(3)早期手术能明显改善预后，对于直径≤1 cm的微小PC(也称为早期PC)术后5年生存率可达70%～100%[10]，因此早发现、早手术对有效治疗PC、改善预后有重要意义。

2.1 循环肿瘤细胞与PC的诊断 早期诊断困难和缺乏有效个体化治疗方案是PC预后差的最主要原因，近年来，CTCs作为PC辅助诊断指标的研究取得重大成就，刘艳辉等[11]采用免疫磁珠负性富集结合免疫荧光方法分离和鉴定CTCs，在PC诊断中的应用价值进行分析，发现CTCs是PC诊断的敏感指标，联合CA19-9与CTCs可显著提高PC的诊断水平。吴斌等[12]对国内外数据库进行检索，对CTCs在PC中诊断价值进行分析，经过筛选总计19项研究693例PC患者和406例非PC患者被纳入，研究认为目前CTCs尚不足以单独作为PC早期诊断指标，但可作为PC诊断方法的重要补充。Martini等[13]为评估CTCs在PC中的诊断应用价值，以关键词“循环肿瘤细胞、PC、诊断与预后”对1999—2019年的研究报道进行回顾，发现不同的富集方法检出率差异较大，但CTCs在PC患者外周血中均可检测到，CTCs有望成为诊断PC的一种工具。

2.2 循环肿瘤细胞与PC的预后 CTCs对PC的预后有着非常好的评估意义，即使是肿瘤灶可切除性患者，术前外周血中检测出CTCs预后也显著差于未检测出者[14]。有学者对PC患者外周血是否存在CTCs与患者的术后复发、生存期的关系进行分析，研究证实检测出CTCs的肿瘤灶切除性PC患者生存期明显缩短，术后复发率显著增高[15]。Yin等[16]发现，在新辅助治疗病理完全缓解PC患者外周血中依然存在CTCs,而且认为可以作为预测术后复发及生存期缩短的生物学指标。Wang等[17]对2019年以前所有关于CTCs在PC预后作用价值的报道进行Meta分析，总计19项研究共1320例患者被纳入，研究结果表明，CTCs阳性PC患者总生存期和无进展生存期均显著短于CTCs阴性患者，CTCs可以作为PC治疗前评估预后的生物标志物。Mandair等[18]利用cellseacrh系统确定了胰腺内分泌肿瘤转移性(panNETs)的最佳阈值为1个/7.5 ml。基于众多成功研究报道，Chapman等[19]利用超声引导下内镜采集门静脉血(PV)CTCs，评估其在PC预后方面的价值，研究证实PV-CTCs可以作为预测PC无进展生存期和总生存期的生物标志物。此外CTCs在向转移播散的过程中伴随着形态的改变，空间异质性也可以作为监测肿瘤灶转移及评估预后的标志物[20]。甚至可以作为判断PC预后的独立预测因子[21]。

2.3 循环肿瘤细胞与PC的疗效评估 在抗癌治疗的打击和肿瘤灶自然进展的驱动下，肿瘤细胞不断地进行突变性增殖，耐药性不断增强，这就需要不断调整抗癌治疗方案；Labib等[22]利用胰腺肿瘤细胞移植小鼠模型进行单肿瘤细胞层面研究，发现药物作用靶点或治疗反应蛋白可以被鉴别，且这些突变蛋白可以预测治疗药物的敏感性和耐药性。传统的穿刺活检属于侵入性有创操作，难以发现肿瘤灶内细胞的异质性，也不能实现实时监测；但外周血中实时检测CTCs能动态反映肿瘤灶内细胞变化，及时选择有效的抗癌治疗，从而达到最佳治疗效果。Sheng等[23]对3例VI期PC 患者进行化疗监测，使用CT进行疗效评估的同时对患者CTCs进行检测，当CT显示化疗有效，肿瘤灶缩小时，CTCs计数也随之降低，因此CTCs计数有望成为新的疗效观察指标。Rivera-Baez等[24]利用体外细胞培养技术成功扩增与PC细胞KRAS突变一致的细胞系，并评估了扩增细胞系用于转移的潜能并检验了细胞系用于细胞毒性实验的效用，对转化型PC研究提供有价值的资源，也为PC的转移和耐药性提供有意义的指导。

2.4 循环肿瘤细胞与PC的治疗 靶向治疗的广泛应用增添了“活检”的使用途径，对于需要进行新辅助治疗的可切除肿瘤灶PC患者而言，传统组织活检最主要的用途就是建立一个组织诊断，以指导术后的辅助治疗，然而要想实时检测以指导治疗传统活检显然是不可行的。HER2(human epithelial growth factor receptor 2)在肿瘤生物学中的作用已在多种肿瘤中被报道，基于HER2的靶向疗法已经显示出显著疗效，Nagarkar等[25]从血液中分离CTCs进行扩增、转录及表达分析，确定了HER2基因的过表达并以过表达蛋白作为治疗靶点，设计出带有曲妥珠单抗、环磷酰胺和氨甲蝶呤的个性化治疗方案，并取得相当好的抗癌疗效，充分显示了CTCs在抗癌治疗中的应用价值。Wang等[26]开发了一种经济有效的静脉导管降低CTCs负荷，导管表面经EpCAM抗体修饰，在外周血循环驱动下，利用抗原-抗体反应富集CTCs,再经近红外光杀灭，有效预防PC复发和转移。针对异质性CTCs为恶性肿瘤转移的“种子”学说，Franses等[27]利用CTC-iChip富集CTCs并对PC患者CTCs进行了全面转录分析，确定了相关基因片段，最终发现LIN28B的表达与患者的预后显著相关，通过细胞及动物模型从异质性CTCs中寻找到治疗靶点，成功开发了针对转移“种子”的靶向疗法。

3 展 望

全世界基因、表达谱及蛋白组学分析方法的快速发展使得寻找具有直接治疗作用的生物标志物成为可能，这些为PC的精准治疗提供了非常好的治疗途径。外周血CTCs检测突破了传统穿刺活检的局限性，通过微创、低成本、高效、实时采集的技术手段获取信息，以监测肿瘤灶的进展、细胞对治疗的反应及寻找治疗靶点[28]；对于中晚期PC患者而言，个性化、精准化治疗方案是提高其生存期的最有效方法[29]，例如，定向基因治疗CRISPR/Cas9技术[30]通过敲入或敲除特定基因从而干预肿瘤细胞的增殖、分化及降低细胞生长、迁移、侵袭和药物抵抗，延缓患者的生存期。尽管CTCs在PC的诊疗中价值不菲，但应用于临床依然还有较多问题：(1)CTCs的应用关键在于其检测技术，目前的检测方法众多，不同的检测方法各有优缺点，检出率层差不齐；(2)CTCs在计数上的最佳阈值有待进一步研究，异质性与PC的关系有待进一步大规模多中心研究；(3)基于CTCs的分子靶向治疗目前还处于动物模型实验阶段。