固相萃取-HPLC法同时测定大米中甲萘威和阿特拉津

朱小亮，许亚南，吴到懋，孙步旭，樊冬玲*

江苏省宿迁环境监测中心（宿迁 223800）

阿特拉津又名莠去津，是一种成本低廉、除草效果好、使用广泛的三嗪类除草剂[1]，其半衰期长，在土壤中积聚不易分解，极易对地下水造成污染，对生物的肝脏、肾脏、心肺和再生繁殖产生损伤[2-3]，甚至引发癌症，位列联合国27种持久性有毒污染物之一[4]。甲萘威又名西维因，是一种广泛应用的氨基甲酸酯类广谱杀虫剂，性质稳定不易分解，对生物体具有高毒性，如肌肉颤动、流泪、瞳孔缩小等乙酰胆碱酯酶抑制症状，甚至致癌[5]。因此，应对食品中甲萘威和阿特拉津进行有效监测。

随着检测技术发展，较多的检测方法被报道。主要检测方法有气相色谱法[6]、气相色谱-质谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-11]、高效液相色谱-质谱法[12-14]、超高效液相色谱-串联质谱法[15-18]。但方法主要是采用气质联用技术或液质联用技术，对试验设备要求较高，检测成本昂贵，对监测人员要求高，不适合推广。试验建立固相萃取-高效液相色谱二极管阵列检测器（DAD）法同时测定大米中甲萘威和阿特拉津的方法。大米经乙腈提取、C18Cartridges柱萃取净化、浓缩，用甲醇定容至2 mL直接测定，样品前处理操作简捷、灵敏度高、方法稳定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），配备二极管阵列检测器（DAD）、色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；RAPid VAP®样品快速浓缩仪（美国Labconco）；康铭超纯水机UPC-20UV（北京康铭时代公司）；EYELA萃取振荡仪MMV-1000W（东京理化器械株式会社）。

甲萘威标准溶液、阿特拉津标准溶液（质量浓度均为100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所）；甲醇、二氯甲烷、乙腈、石油醚、正己烷（均为色谱级，德国Merck公司）；无水硫酸钠、氯化钠（高级纯，国药试剂）；自制高纯水。

1.2 标准曲线的绘制

按照逐级稀释的方式配制标准浓度点，先将甲萘威（100 μg/mL）和阿特拉津（100 μg/mL）标准溶液稀释为质量浓度20 μg/mL混合标准使用液，充分摇均备用。将甲萘威和阿特拉津标准使用液用甲醇稀释为0，0.02，0.20，0.40，0.60，1.00和2.00 μg/mL这7个质量浓度，按照仪器优化条件进行测定，分别以甲萘威和阿特拉津的峰面积对质量浓度绘制标准曲线。

1.3 前处理方法

准确称取5.00 g经粉碎的大米，置于50 mL离心管中，向其中加入25 mL乙腈溶液，浸泡24 h后，将离心管置于振荡仪上充分振荡萃取30 min，静置10 min后，以5 000 r/min离心5 min，转移上清液于浓缩瓶中，浓缩后加入3 mL甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）混匀，待净化。将C18Cartridges用5 mL甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）活化后上样，再用甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）洗脱液洗脱5次，洗脱液通过氮吹浓缩仪浓缩至近干，用甲醇定容至2 mL，混匀，过0.45 μ m滤膜后入2 mL的色谱瓶中，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱Eclipse XDB-C18反向柱（4.6 mm×200 mm，5 μ m）；流动相采用甲醇-水（60∶40，V/V），流速0.4 mL/min，柱温40 ℃；二极管阵列检测器（DAD）波长220 nm；进样量5.0 μL。

2 结果与分析

2.1 萃取试剂选择

考察4种常用的农药类有机萃取试剂（正己烷、乙腈、甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）、石油醚）对甲萘威和阿特拉津的提取效率，样品加标回收率试验，重复测定6次，并通过平均回收率高低来选择萃取试剂，见表1。结果表明，乙腈对甲萘威的回收率为91.3%，明显优于其他；正己烷、乙腈、甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）对阿特拉津的回收率均较高，优于石油醚；综合分析乙腈对大米中甲萘威和阿特拉津的提取效率均大于90%，提取效果较好，故试验采取乙腈为甲萘威和阿特拉津的萃取试剂。

2.2 色谱特性

将质量浓度均为1.5 μ g/mL甲萘威和阿特拉津混合标准溶液，流动相采用甲醇-水（60∶40，V/V），流速0.4 mL/min，按照测试方法通过液相色谱分析，标准色谱图见图1，典型样品色谱图见图2。由图1知，甲萘威与阿特拉津在色谱图上出现明显2个峰，分离完全，无拖尾现象，峰肩对称尖锐，基线平稳，可用于甲萘威与阿特拉津的定量分析。

表1 4种提取剂的回收率

图1 甲萘威和阿特拉津标准色谱图

图2 典型阳性样品色谱图

2.3 分析波长的选择

使用二极管阵列检测器（DAD）对质量浓度为1.5 μg/mL甲萘威和阿特拉津标准溶液分别进行全波段（190～400 nm）扫描，以选择最佳检测波长，扫描谱图见图3。甲萘威在220 nm与280 nm处有2个吸收峰，其中在220 nm处的吸收强度较强；阿特拉津在220 nm与260 nm处有2个吸收峰，其中在220 nm处的吸收峰较强，发现2种物质在220 nm均有较强吸收峰，且无干扰峰，故选择220 nm作为同时测定甲萘威和阿特拉津最佳吸收波长。

2.4 流动相分流比选择

试验以甲醇-水（60∶40，V/V）和乙腈-水（60∶40，V/V）2种体系作为流动相进行分离效果试验。结果发现2种流动相体系均能对甲萘威和阿特拉津进行分离，但基于乙腈成本高、有毒，同时甲醇具有柱压低、分离快、峰对称尖锐的优势，故试验选择甲醇-水为流动相。同时设置不同体积比（80∶20，70∶30，60∶40，V/V）的甲醇-水流动相分别试验，结果见图4。甲醇-水体积比80∶20时，甲萘威和阿特拉津出峰较快，虽然2种化合物得到分离，但存在底液峰重叠干扰，无法排除；甲醇-水体积比70∶30时，同样存在底液峰干扰，且甲萘威峰肩不对称；甲醇-水体积比60∶40时，甲萘威与阿特拉津完全分离，出峰时间分别为3.81和5.11 min。随着甲醇体积减少，2种化合物分离效果变好，但发现峰形变宽，保留时间延长。综合分析后，试验选择甲醇-水（60∶40，V/V）作为流动相。

图3 甲萘威和阿特拉津紫外波长扫描图

图4 不同体积比流动相试验

2.5 流动相流速和柱温

在甲萘威和阿特拉津质量浓度均为1.5 μg/mL、甲醇-水（60∶40，V/V）流动相下，对0.4，0.8和1.0 mL/min 3种流动相流速进行分离效果试验，色谱图见图5。随着流速增加，2种化合物的分离效果变差；流速0.4 mL/min时，甲萘威和阿特拉津分离完全，峰形对称，底液无干扰，且测定时间适当，故试验选择流动相流速0.4 mL/min。对20，30和40 ℃ 3种色谱柱柱温进行比对试验，结果差别不大，保留时间随柱温升高仅稍有缩短，因而选择柱温40 ℃。

图5 不同流动相流速下试验

2.6 线性关系及检出限

在最佳试验条件下，按照逐级稀释的方式，分别配制质量浓度为0，0.02，0.20，0.40，0.60，1.00和2.00 μg/mL甲萘威和阿特拉津标准混合溶液，按照检测方法通过高效液相色谱进行测定，色谱图见图6。甲萘威与阿特拉津分离完全，质量浓度与峰面积呈较好的线性关系。结果表明，在0～2.0 μ g/mL范围内均呈现良好线性相关性，见图7，甲萘威曲线方程为y=377.405 3x+4.064 5，相关系数R2=1.000；阿特拉津曲线方程为y=178.245 1x+2.113 4，相关系数为R2=1.000。试验以3倍信噪比来确定最低检出限，10倍信噪比确定定量限，该测定方法甲萘威和阿特拉津检出限分别为1.0和3.0 μ g/kg，定量限分别为3.3和10 μ g/kg。

图6 不同浓度下甲萘威与阿特拉津色谱图

图7 甲萘威和阿特拉津的线性方程

2.7 准确度和精密度试验

在最佳检测条件下，分别量取100 mL空白水样，并加入甲萘威和阿特拉津混合标准样品，浓度均为0.2，0.4和0.8 mg/kg，按照试验检测方法进行萃取、除水、浓缩、净化，定容后进行测定，每种浓度重复测定6次，分别计算样品的加标回收率和相对标准偏差（δRSD）。结果发现在低、中、高3种不同浓度下，甲萘威和阿特拉津回收率分别为88.3%～102.2%和87.5%～104.3%，相对标准偏差（δRSD，n=6）分别为1.2%～3.3%和2.3%～4.7%，具体见表2。结果表明该检测方法具有较高准确度和精密度，可用于大米中甲萘威和阿特拉津的定量测定。

表2 精密度和准确度试验（n=6）

2.8 样品测定

在最佳检测条件下，采购于市场中3个厂家大米，按照检测方法进行提取、净化、浓缩，定容后进行测定，同时进行加标回收率试验，结果见表3。结果发现，3个样品均未检出甲萘威及阿特拉津。通过10 μg加标量模拟实际样品。结果发现水样中甲萘威和阿特拉津回收率较好，甲萘威和阿特拉津的回收率分别为95.4%～102.3%和94.6%～104.2%，表明该方法可用于大米中甲萘威和阿特拉津测定。

表3 3种大米实际样分析及加标回收率

3 结论

通过优化色谱工作条件，建立固相萃取-高效液相色谱二极管阵列检测器（DAD）同时测定大米中甲萘威和阿特拉津的方法。在0～2.0 μg/mL范围内，2种化合物均呈现良好的线性关系，甲萘威曲线方程为y=377.405 3x+4.064 5，相关系数R2=1.000，检出限1.0 μg/kg；阿特拉津曲线方程为y=178.245 1x+2.113 4，相关系数R2=1.000，检出限3.0 μg/kg。对低、中、高3种不同浓度下甲萘威和阿特拉津准确度和精密度试验，回收率分别为88.3%～102.2%和87.5%～104.3%，相对标准偏差（RSD，n=6）分别为1.2%～3.3%和2.3%～4.7%。该方法稳定性好，操作简单，灵敏度高，满足于大米中甲萘威和阿特拉津的测定。