基于全场光学相干层析图像的人体肝组织癌变定量特征分析研究

张欣萌，高万荣*，朱 越，徐新宇

（1. 南京理工大学电子工程与光电技术学院，南京 210094；2. 江苏省肿瘤医院病理科，南京 210009）

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，在医学上经常通过观察肝组织图像来判断肝组织是否发生癌变［1-7］。目前应用于肝癌临床诊断的成像方法主要有两种，即X线计算机断层扫描（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。CT具有高的密度分辨力，可以更好地显示由软组织构成的器官，如脑、脊髓、纵隔、肺、肝、胆、胰以及盆部器官等，并能在良好的解剖图像背景上显示出病变的影像［4］。但是，CT扫描在低血供方面的诊断还存在较大问题，在诊断时可能会出现漏诊的情况，影响检出率［5-6］。相比于CT成像，MRI拥有多个成像参数，且在软组织医学成像上的对比度更好，可任意方向断层成像，对人体无电离辐射伤害［7］。然而CT和MRI对于肝脏组织成像的分辨率有限，不能够对微小的结构进行观察。为了能够更全面地了解肝癌组织与正常肝组织的区别，从微观上将它们予以区分，我们提出采用全场光学相干层析（full field optical coherence tomography，FFOCT）系统来对正常肝组织与肝癌组织进行成像。

FFOCT系统基于Linnik结构干涉仪，利用生物组织的后向散射光与参考光的弱相干干涉来提取生物组织的结构信号，并通过计算机进行图像处理，从而进行层析成像。1998年，Beaurepaire等［8］提出了全场光学相干层析术这一概念，该试验系统的建立是为了弥补光学相干层析（optical coherence tomography，OCT）系统的很多不足。首先，FFOCT系统采用面阵电荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）对样品进行并行扫描，可一次性得到带有二维信息的图像，比进行逐点扫描的OCT系统成像速度更快；其次，FFOCT系统采用卤钨灯作为光源，并在参考臂和样本臂两臂放置两个完全相同的显微物镜，这样不仅得到了更高的横纵向分辨率，降低了成本，而且避免了信号的串扰［9-10］。与普通显微镜相比，由于FFOCT系统中仅使用测量信号的干涉分量来产生正面断层图像，故能够在抑制背景强度的同时增强图像的对比度［11］。与荧光显微镜相比，FFOCT系统不需要标记或者预处理，大大节省了成像时间。与共聚焦显微镜相比，FFOCT系统提供了更大的对比度和成像深度［12］。

由于FFOCT系统具有活体成像、非侵入、非破坏性、实时、快速、无需标记或预处理、横纵分辨率高、检测灵敏度高等诸多优点，目前其已被用于诊断固定和非固定组织样本。美国圣路易斯华盛顿大学生物医学工程系首次报道了利用FFOCT系统对人类卵巢组织样本所成的FFOCT图像进行定量形态学分析和特征提取，并以此来辨别正常和恶性的人类卵巢组织样本［13］。法国巴黎Langevin研究所使用FFOCT系统对小鼠肝脏、人类肺癌、人类乳腺组织、人类视网膜、角膜以及指纹等进行了检测成像［14-19］。本课题组也曾使用FFOCT系统对洋葱、猪肝、人体结肠与肾脏组织、肝组织等进行了层析成像以及基础的形态分析等［10，20-22］。

目前对使用FFOCT系统获得的组织图像的分析主要是基于观察者对所得的FFOCT图像的常规经验的判断，即根据样本的生物学特性以及形态特征对所得到的FFOCT图像进行辨识，寻找已知的基本结构和组织单位，从而进行判断和鉴别［21，23］。虽然经过训练的病理学家和专业人士可以对大部分FFOCT图像作出正确的解释，但是在面对一些组织结构发生细微改变的样本的FFOCT图像时，他们无法直接用肉眼判断其是否是癌变组织。此时应考虑对这种FFOCT图像进行定量分析，从FFOCT图像中寻找能够判断出生物组织是否发生癌变的特征参数，避免因人为因素导致判断结果不准确，从而增加FFOCT系统在生物医学临床应用中的可行性。

搭建基于Linnik结构干涉仪的FFOCT系统并对人类正常与癌变肝组织分别进行成像，结果发现对于癌变特征明显的肝组织FFOCT图像，可以根据正常肝组织与癌变肝组织不同的特性，通过肉眼辨识出人类肝组织FFOCT图像是正常的还是发生癌变的。显然，对一些早期肝癌或者处在正常与癌变区域的边界处的病变，由于生物组织结构变化细微，仅凭肉眼并不能直接从图像中辨别出来。为了使FFOCT系统获取的光学断层图像能应用于肝组织癌变的早期诊断以及准确确定正常与癌变区域的边界，本研究对所获得的正常肝组织FFOCT图像和癌变肝组织FFOCT图像分别进行了形态学分析与灰度特征提取，以便为病理学医生进行定量癌症诊断提供新的手段。

首先，根据已知的正常与恶性癌变肝组织的形态学差异，选取具有代表性的特征参数，对FFOCT图像进行灰度特征提取。我们先从正常和癌变肝组织的FFOCT图像的标准化直方图中定量提取五个特征，这些特征分别是平均值、方差、偏度、峰度和熵值。接下来，为了验证这五个特征参数的值在正常与癌变肝组织FFOCT图像中是不同的，我们求出所有的肝组织FFOCT图像的五个特征参数的值，利用统计学中的t检验寻找正常与癌变的肝组织的FFOCT图像的特征参数的值的区别。

1 材料与方法

1.1 样品准备

本试验所使用的样本由江苏省肿瘤医院病理科提供，分别是人体正常肝组织与人体癌变肝组织。样本离体后用生理盐水保存，以便在试验过程中使用。

1.2 FFOCT系统成像原理

图1显示了搭建的FFOCT系统的结构的原理图。该系统主要由柯勒照明系统和Linnik结构干涉仪组成。使用卤钨灯（中心波长为550 nm，光谱带宽为200 nm，相干长度为1.5μm）作为光源，在降低成本的同时也更加的安全。柯勒照明系统不仅提供了均匀的照明光，而且使得照明范围随时可调。使用一对完全相同的显微物镜［Olympus，20×，数值孔径（numerical aperture，NA）为0.5］，两个显微物镜与样品和参考镜之间无需放置其他光学器件，这样使得使用大数值孔径显微物镜成为可能，因此可以获得更高的横向分辨率。钇铝石榴石晶体（yttrium aluminate-garnet，YAG）作为参考镜附着在压电陶瓷（piezoelectric ceramics，PZT）的前端，并使用PZT改变光程来进行四步移相，从而提取干涉信号。另外，Linnik结构的参考臂和样品臂可以独立调节，这样就可以独自对两臂的光程进行调整。由于光源采用的是卤钨灯，相干长度极短，故只有样品臂和参考臂之间的光程差接近完全相等时才能发生干涉并具有最大的相干强度，这时样品与参考镜之间的像才能被恢复出来。因此，参考镜在轴向移动的过程中可以选择与样品中光程相等的对应层进行成像，而其他层的信息将会被滤掉，这就是光的相干断层成像。面阵CCD（Matrox Iris GT300，像元大小为7.4μm×7.4μm，帧率为110 frame/s）用来采集干涉信号。试验测得所搭建的FFOCT系统的横向分辨率为1.65μm，轴向分辨率为1.3μm，由于测量的样本不同，故成像深度为50～300μm。

图1 全场光学相干层析系统原理图Fig. 1 Schematic of full-field optical coherence tomography system

主系统中，光源发出的光经过柯勒照明系统到达分光棱镜（beam splitter，BS）。分光棱镜将光源发出的光分为两部分：一部分经过显微物镜到达参考镜后返回；另一部分经过另一个显微物镜到达样本后返回。返回后的两束光经过会聚透镜到达CCD发生干涉，获得的图像通过计算机进行图像处理，得到最终需要的FFOCT图像。

面阵CCD上任意一点P（x，y）接收到的信号可以表示为：

式中：I0（x，y）为非相干光形成的背景光，Ai（x，y）为第i层的点P（x，y）处的振幅，cos［ϕ（x，y）］为点P（x，y）处的干涉信号。为从得到的CCD信号中解调出层析图像，我们应用四步移相法，对参考臂的光程进行调制，此时CCD接收到的信号可以表示为［21］：

故最终得到的第i层的点P（x，y）处的层析信号为：

式中n代表参考臂移相时不同位置的编号，I1、I2、I3、I4分别为参考臂的相位移动为时CCD所接收到的信号。Ai（x，y）表示样品与参考镜的互相关光强，也是我们要求的层析信号。这里，Ai（x，y）与重建的正面断层图像的灰度值成正比。因此，（x，y）越大，则对应的第i层的点（x，y）处的灰度值越大。

1.3 人体离体肝组织的FFOCT图像分析

在影像学诊断中，分化差的肝细胞癌由于异型明显等可直接鉴别出是否发生癌变。而在本试验中需要关注的则是早期高分化的肝细胞癌，这种癌症具有体积小、边界清、细胞的异型性不甚明显的特点。但肝细胞癌中细胞密度增加更为明显、肝板紊乱、形成小梁和假腺管、肝窦不规则扩张、间质浸润等也是重要的鉴别指标［24-25］。本文主要研究的是肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。

试验采用了FFOCT系统对正常与癌变的肝组织成像并通过计算机进行处理。试验中，我们先得到肝组织表面的图像，再逐渐改变样本的轴向位移，对其样本表面下20、40、60μm等深度分别进行成像，直到无法显示出样本的结构信息为止，最后再使用计算机对原始图像进行处理。从处理后的结果图像中分别选取效果较好的15幅正常肝组织FFOCT图像和15幅癌变肝组织FFOCT图像。15幅癌变肝组织FFOCT图像记为A组，15幅正常肝组织FFOCT图像记为B组，从A、B两组中分别选取1幅图像，如图2所示。

图2 FFOCT系统对肝组织成像的正面断层图Fig. 2 En face images of human liver tissue with FFOCT

对于肝的FFOCT图像如上图2所示。这些细胞具有大的圆形核，图2a中细胞质环绕在直径20μm左右的核仁处，故被认为是肝细胞，而肝窦则是可膨胀的血管通道，又能明显可见正常的肝组织纤维带。而图2b中明显是肝组织的病灶特征，但无法判断出具体的病变类型。

这里值得指出的是，在采集图像之前，首先进行的是样本区域的选择，选取成像效果较好的癌变肝组织区域以及正常肝组织区域。其次再进行图像的采集与处理，进而重建FFOCT正面断层图像。本工作中所得到的FFOCT图像的视场大小为400μm×300μm。定量分析就是对整张图像的灰度特征进行提取分析。因此，本文中的定量分析结果对应的就是一系列整张的FFOCT图像。

1.4 FFOCT图像特征提取

由图2可知，对肝的FFOCT正面断层图像作出正确的判断，需要有充分的理论依据。首先，要知道所检测的疾病的具体特征，譬如分化差的 HCC由于异型明显、浸润生长及癌栓、卫星灶明显而较易诊断，但早期高分化小HCC的鉴别则需要更为细致的判别。早期高分化 HCC体积小、边界清、细胞异型性并不明显，但其具有细胞密度增加更为明显、肝窦明显扩张不规则等特点［24］。如变异肝细胞病灶（focus of altered hepatocytes，FAH）就是由形态不同以及化学表型不同的细胞构成的，具有一定的不稳定性和异质性。由于肝癌的情况较为复杂，为了对FFOCT图像作出正确的判断，要求判别图像的工作人员要具备较高的专业能力，否则有可能引起图像误判。然而，对肝组织的FFOCT正面断层图进行特征提取，以定量的形式来描述得到的FFOCT正面断层图像可以避免上述情况。

对于医学图像特征提取算法，大体可以分为三大类： 颜色（灰度）特征提取、纹理特征提取和形状特征提取。而FFOCT图像属于灰度图像，在此主要进行灰度特征提取。基于对图像的分析，目前采用如下几个统计量来反映FFOCT图像的特征。

其中x是第i个像素的灰度级，N是像素总数。为图像的平均像素强度，σ为图像的像素灰度值的标准差，p（xi）为概率，即灰度级为x的像素所占的比例，可由灰度直方图获得［10］。均值可以体现平均像素强度。方差可以体现图像灰度直方图分布的离散程度。偏斜度反映图像直方图分布的不对称性，偏斜度的值越大，说明图像越不对称。峰度指的是图像直方图的平坦度。熵值被用来表示图像的不规则性。我们按照公式（4）～（8）分别对A、B两组的图像进行处理并使用统计学的方法对得到结果进行分析。

2 结果与分析

我们对两组图像均进行了五个特征参数的计算，并得到了十组不同的数据。为了增加结果的可读性以及科学性，我们将分析每个特征参数在这两组图像中的不同之处。在此，我们选用统计学中的箱型图以及t检验进行分析，得到结果如图3所示。

图3 正常肝组织与癌变肝组织的箱型图与P值Fig. 3 Box plots and P values of normal liver tissues and cancerous liver tissues

由图3a可知，肝癌的FFOCT图像与正常肝组织的FFOCT图像相比，图像平均强度较低，两者差异显著，故均值可以作为区分肝组织是否癌变的标准之一。由图3b～3d可知，肝癌的不对称性较小，较平坦且离散程度也是较小的，而正常肝组织与之刚好相反，故肝组织癌变与否也可以用这三者作为评判标准。由图3e可知，肝癌组织熵值的分布与正常肝组织熵值的分布没有规律，且P＞0.05，表明两组数值没有显著差异，故不能将熵值作为评判一幅肝组织FFOCT图像是否癌变的标准。

通过对正常肝组织与早期肝癌组织FFOCT图像的分析与计算发现，肝组织FFOCT图像的均值、偏度、峰度与方差均可以作为评判一个肝组织样本是否发生癌变的参考值，而熵值则不能。由于选取的这些灰度特征都没有考虑图像的空间特性，故不能认为用其中某一个特征参数就可以对一幅FFOCT图像作出评判。为了能够提高判定的准确度，我们不能只使用一个特征参数，而是需要多个特征参数同时测量，相互验证，来得到更加准确的试验结果。本试验证明可以使用人体肝组织FFOCT图像的灰度特征来验证人体肝组织是否发生癌变。在今后的工作中，我们应结合临床医学的需求，首先选取多组不同癌变种类的肝组织样本对其进行层析成像，并对所成的FFOCT图像进行灰度特征提取与统计分析，再将成像过后的试验样本使用苏木精-伊红染色法来进行试验结果验证。研究的主要目标是利用大量的数据进行统计分析，找到正常肝组织与癌变肝组织FFOCT图像的特征参数的数值阈值以及两者的特征参数的数值差异，证明肝组织FFOCT图像的灰度特征可以作为评判一个肝组织样本是否发生癌变的评判标准。

3 讨论

对于肝癌的诊断，目前临床上大多先采用CT、MRI等手段对肝组织进行成像，再由病理学家对所得的图像进行甄别，判定是否有象征癌症的结节或肿瘤等。为了进行确诊，往往还需要进行病理检查。但癌症的发展是有一定的过程的，能够在癌变的早期对生物组织的状态进行判断，从而实现对癌症做到早发现、早治疗是非常必要的。在癌变的早期，肝组织的细胞等发生的一系列变化可能比较微小，大范围的CT、MRI检查等可能会造成漏诊。

为了观察肝组织细胞的早期癌变特征，我们可以利用FFOCT系统的微米分辨率成像特性对肝组织进行成像，并提取FFOCT图像的灰度特征，得到样本FFOCT图像灰度特征的特征参数的值，期望根据这些特征参数的值判断样本是否具有早期癌变特征。实际上，已有的研究表明，利用FFOCT系统可以得到许多生物组织样本微米级别的光学断层图像。本课题组曾利用FFOCT系统得到清晰的洋葱表皮细胞图像［9］、猪肝细胞图像［10］、人体离体的结肠、肾脏、肝等组织的图像，并对所得到的图像进行初步的辨识和分析［20-22］。法国Langevin研究所利用FFOCT系统对人体视网膜、角膜等进行成像，结果能够得到较为清晰的眼部结构，这为眼科方面的临床诊断提供了很大的研究价值［15-17］。同时，Langevin研究所用FFOCT系统对手指进行成像，得到了手指的内部指纹以及汗孔的图像，这避免了传统传感器因手指有疤痕或褶皱、太湿或太干等原因而导致的指纹识别不成功的情况［18］。在疾病诊断方面，目前多是将生物组织样本进行成像，得到样本的FFOCT图像后利用生物学知识对样本进行人眼观察，寻找与正常组织不同的病变组织，再利用病理学手段对样本进行染色，以检验判断是否正确。目前已将FFOCT应用于人体离体的正常卵巢组织与癌变卵巢组织［13］、正常乳腺组织与癌变乳腺组织［19］等，对这些组织所成的FFOCT图像进行观察，并使用一定的统计学手段进行分析，从而鉴别出组织是否癌变。

在本研究中，我们先对人体离体的肝组织进行成像，对所成的FFOCT图像进行人眼观察以及形态学分析，以揭示正常肝组织与癌变肝组织FFOCT图像的灰度特征。研究证明，正常肝组织与癌变肝组织FFOCT图像的灰度特征，包括均值、偏度、峰度与方差均具有不同的特征，从而可以以这些参数值的变化特征作为判断肝组织样本是否发生癌变的诊断参考。

此外，目前利用FFOCT系统进行的研究主要是对离体的人体组织和器官进行成像，活体成像仅限于对手指、眼睛等，且样本数量有限，并未进行大量的试验验证。为了进一步确定FFOCT系统在癌症诊断方面的价值以及定量分析的重要性，接下来应该进行大量的样本试验，并对不同的组织分别进行研究，再将不同的组织进行比较，研究其共性和差异。