植物中水杨酸合成途径及其调控的研究进展

黄红晶，詹 蔷，覃 磊，b，彭志红，夏石头，b*

（湖南农业大学 a. 生物科学技术学院；b. 植物激素与生长发育湖南省重点实验室，长沙 410128）

水杨酸（salicylic acid，SA）是一类广泛存在于植物体内的酚类植物激素，对植物的生长发育和抗性具有显著调控作用。SA不仅对植物的光合作用产生影响，进而调节植物生长过程中的种子发芽、开花、膜通透性及气孔关闭等［1-2］，而且能够诱导植物产生系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）［3］。SAR是一种激活局部防御导致植物远端抗病性增强的现象，一方面，植物局部组织如叶片由于病原体感染会导致SA含量急剧上升，从而诱导整株植物包括远端组织都产生持久的广谱抗性；另一方面，直接施用SA可诱导植物的高抗性产生局部组织坏死的超敏反应等。上世纪90年代，SA被逐步发现为SAR的信号分子［4］。早在1979年，White等［5］首次报道了SA是植物抗病性的诱导剂。随后，SA在SAR中的重要作用被细菌的SA降解酶——水杨酸羟化酶，在转基因烟草中的表达试验所验证［6］。而有关SA生物合成或感知缺陷的拟南芥突变体的研究则进一步证实了SA在SAR中的重要性［7］。在拟南芥中，SA被两类受体NPR1和NPR3/NPR4感知，它们在调节SA反应基因中具有相反的作用［8］。 SA抑制NPR3/NPR4的转录抑制活性，同时促进NPR1的转录激活活性［9］。然而，高等植物合成SA的途径一直未知，并引起了科学家们的广泛关注。本文综述了植物中SA完整合成途径的发现以及SA合成中的调控机制方面的最新研究进展。

1 SA的生物合成途径

SA的合成途径主要有：1）莽草酸途径中莽草酸的转化物苯丙氨酸首先在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）的作用下生成反式肉桂酸（trans-cinnamic acid，trans-CA）［10］，然后再转化为邻香豆酸（o-coumaric acid，o-CA）或苯甲醛。邻香豆酸可直接转化为SA，但苯甲醛需要先转化为苯甲酸，再在苯甲酸羟化酶（benzoic acid 2-hydroxylase，BA2H）的作用下转化为SA［11］；2）异分支酸途径中细菌SA的生物合成是通过异分支酸合酶（isochorismate synthase，ICS）使分支酸（chorismic acid，CA）异构化为异分支酸（isochorismate，IC），再经过异分支酸裂解酶（isochorismate pyruvate lyase，IPL）合成SA［10］（图1）。在拟南芥植株中存在两种ICS基因，即ICS1和ICS2，二者都定位于质体中。与ics1 ics2双突变植物类似，在ics1单突变体中，病原体诱导的SA积累被阻断，且SA水平进一步降低，表明ICS1在病原体诱导的SA中起主要作用，而ICS2则起次要作用［12］。然而，至今仍未发现植物中存在IPL基因或类似编码细菌IPL蛋白的DNA序列［13］。因此，在植物中IC如何转化为SA是一个未解之谜。最新研究中，植物中IC转化为SA的途径有了新的突破。

2 植物中SA完整合成途径的发现

2007年，Nobuta等［14］发现编码氨基转移酶的avrPphB易感性3（avrPphB susceptible 3，PBS3）突变也降低了病原体诱导的SA积累。然而，多年来人们一直不清楚PBS3如何促进SA的积累。2019年Rekhter等［15］首先注意到，拟南芥中PBS3与催化茉莉酸-亮氨酸复合物［16］形成的氨基酸转移酶ATGH3.11同属于GH3蛋白家族，其突变体pbs3中SA的含量减少，且PBS3蛋白并不能以SA作为底物。进一步研究发现snc2-1D npr1-1 pbs3和npr2-1 npr1-1 eds5-3两种三突变体表型类似，都不能恢复双突的矮化表型，且PBS3和增强型易感病性5（enhanced disease susceptibility 5，EDS5）突变都能显著降低snc2-1 npr1-1突变体［17］中SA及其衍生物的含量，但前者有SA前体IC的累积，据此推测IC可能是PBS3蛋白的作用底物。通过异源表达系统纯化PBS3蛋白和质谱分析，发现PBS3蛋白可以催化分支酸（CA）的C7和C9位谷氨酸化而生成CA-7-Glu（C7）和CA-9-Glu（C9），也可以IC为底物生成IC-9-Glu，且对后者表现出偏好性。在溶液中，IC本身可慢慢衰变为SA［18］，若去除Glu、ATP或PBS3蛋白，SA生成速率均比完全反应时显著下降。反应动力学分析证明PBS3对IC具有高亲和力和催化效率，而PBS3-SA-AMP晶构的数据模拟等也都表明，PBS3可能直接参与SA的生物合成［14］。

在对snc2-1 npr1-1、snc2-1D npr1-1 pbs3和npr2-1 npr1-1 eds5-3三种突变体中代谢物进行检测时，发现只在snc2-1 npr1-1突变体中含有分解产物SA，且体内、外来源的IC-9-Glu具有一致的二元图谱，说明IC-9-Glu是植物体内SA的前体，可分解为SA。而前人有关sid1 eds5突变体的研究表明，EDS5的突变导致SA水平大大降低［19］， EDS5定位于叶绿体被膜，这意味着它可以将SA或其前体转运到胞质中［20］。而PBS3就是一种胞质定位蛋白［21］。基于此，为验证PBS3蛋白的亚细胞定位，将ICS1的叶绿体转运信号肽与PBS3-YFP的N端融合构建chloroPBS3-YFP载体［19］，与ICS1-CFP质粒共转入拟南芥叶片后，发现PBS3和ICS1共定位在叶绿体中；而在拟南芥叶片中仅瞬时表达PBS3-YFP融合蛋白时，观察不到荧光信号。与此同时，将chloroPBS3与ICS1共转入eds5-3突变体时，可将其SA累积缺陷恢复至野生型，而PBS3单转或者与ICS1共转都不能恢复其野生型表型，说明EDS5将经ICS1催化形成后的IC转运出叶绿体，在细胞质中由PBS3将其转化为IC-9-Glu。该试验结果否定了整个异分支酸途径都在叶绿体中进行的猜想［20］，为证实EDS5作为SA运出叶绿体的转运蛋白提供了有力的证据。

与此同时，Michael等［22］根据PBS3和增强型假单胞菌敏感性1（enhanced pseudomonas susceptibility，EPS1）编码的酰基转移酶在SA代谢中的潜在作用，利用SA分解代谢缺陷型s3h dmr6双突变体，构建了s3h dmr6 pbs3和s3h dmr6 eps1三突变体。代谢产物分析结果表明，与s3h dmr6双突变体相比，pbs3和s3h dmr6 pbs3两种突变体中三种代谢产物信号缺失，分别为IC-Glu 两种同分异构体及其降解产物2HNG，说明IC-Glu加合物可能是PBS3的催化反应产物。而eps1单突变体和s3h dmr6 eps1三突变体则拥有比s3h dmr6双突变体更高水平的IC-Glu加合物信号，说明EPS1可能作用于IC-Glu加合物的下游分解途径。然而，IC-Glu加合物可进行自发分解，所以EPS1不是SA生物合成基本途径中必要组分。

综上所述，拟南芥中的IC通过EDS5转运蛋白转运至细胞质，PBS3蛋白作为氨基转移酶催化IC形成异分支酸谷氨酸加合物IC-9-Glu，随后IC-9-Glu自发或在EPS1酶促方式下分解形成水杨酸SA（图1），从而补全了植物中SA合成途径的最后一个环节。

图1 植物中SA的合成路径Fig. 1 Synthetic pathway of SA in plants

3 SA生物合成的正向调控

3.1 SARD1和CBP60g对SA生物合成的促进作用

由于ICS1催化了病原体诱导的SA合成的重要步骤，因此它在转录水平上受到复杂的调控。研究表明一些转录因子参与了ICS1的调控，其中系统性获得性抗性缺陷1（SAR-deficient 1，SARD1）和钙调素结合蛋白60g（CaM-binding protein 60g，CBP60g）是直接调节病原体诱导的ICS1表达的两个关键转录因子［23］（图2）。SARD1和CBP60g属于同一个植物特异性转录因子基因家族，两者在病原感染中都有很强的抗性诱导作用。CBP60g（At5g26920）是拟南芥CBP60钙调素（CaM）结合蛋白家族的一个成员，缺乏其他家族成员的C末端CaM结合结构域，其CaM结合结构域位于蛋白质N末端，该基因突变会致使SA信号缺失。CBP60g在控制SA水平和限制病原体生长方面的功能需要CaM的结合能力［24］，这表明CBP60g响应PTI Ca2+通量并促进SA积累。而多重序列比对结果表明SARD1缺乏其他家族成员所具有的两个CaM结合结构域［25］。生物素化钙调素结合试验表明，GSTCBP60g与CaM结合，但GST-SARD1不与CaM结合，表明SARD1非CaM结合蛋白。

在sard1 cbp60g双突变体中，ICS1和SA的积累几乎完全被阻断。进一步研究发现，CBP60g和SARD1的中心结构域结合SA诱导缺陷2（SA induction deficient 2，SID2）启动子中的GAAATTTGG基序［26］，表明CBP60g和SARD1转录因子通过调节SID2的表达水平从而影响SA含量。虽然SARD1与CBP60g非常相似，两者具有类似的DNA结合结构域，但CBP60g只携带一个位于N末端部分的CaM结合基序。研究发现接种Pseudomonas syringaepv.maculicola（P.s.m.）ES4326后，SARD1直到接种24 h后才被显著诱导表达，而CBP60g的表达是在接种P.s.m.ES4326 6 h后诱导的；SARD1而非CBP60g的过表达足以激活ICS1的表达。这表明两者的表达受到不同的调控，SARD1的主要激活机制可能在转录水平，而转录后水平上 Ca2+/CaM的调节对CBP60g的激活更为重要［27］。

TGA（TGACG motif-binding factor）转录因子能够特异性地与TGACG为核心的激活序列相结合，调节靶基因的转录水平，在植物防御反应中发挥重要作用。研究发现，tga1-1 tga4-1双突变体中病原体诱导的SARD1和CBP60g的表达急剧降低，表明SARD1的诱导需要TGA1和TGA4。在遭受病原体侵染时，拟南芥TGA1和TGA4被激活，并有助于SARD1和CBP60g的诱导表达。然而，TGA1与CBP60g启动子区域不结合，而与SARD1启动子区域结合，表明TGA1通过另一转录因子间接调节CBP60g的表达，SARD1是TGA1的直接靶基因［28］（图2）。

3.2 其他正调控因子

除了SARD1和CBP60g外，其他几种转录因子也参与了ICS1表达的正调控。2015年，Wang等［29］发现在ICS1的启动子上，还存在一个典型的TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF（TCP）结合位点，通过酵母单杂交检测发现TCP8与ICS1的启动子结合。且在P.s.m.ES4326感染后期，tcp8 tcp9双突变体中ICS1表达的诱导和SA的积累被适度降低，表明TCP8和TCP9可能是ICS1的转录激活因子（图2）。同年，Zheng等［30］通过酵母杂交分析还鉴定了直接结合ICS1启动子的转录因子NTM1-LIKE 9（NTL9）和CCA1 HIKING EXPEDITION（CHE）（图2），进一步的分析表明，它们在特定的免疫反应中调节ICS1的表达和SA的生物合成。NTL9促进气孔免疫中的ICS1表达和SA生物合成。CHE参与SAR期间ICS1和SA水平的昼夜节律调节，促进ICS1表达的诱导和SA在远端组织中的蓄积。在酵母单杂交检测中，NTL9和CHE也与ICS1启动子结合。在保卫细胞中，由flg22介导的ICS1的诱导表达需要NLT9，而CHE参与植物系统组织中由病原体诱导的SA生物合成和SA水平的生理调节。

植物防御素缺陷4（phytoalexin deficient 4，PAD4）和EDS1是SA合成途径中的上游调控基因，其编码产物PAD4也是EDS5表达所必须的调控因子（图2）。在pad4 eds1的双突变体中，植物丧失SAR，且SA的积累显著下降，表明PAD4和EDS1也是植物体内的SA积累和PR1基因的表达所必需的［31］。此外，WRKY家族转录因子WRKY28和WRKY46也作为ICS1的正调控因子在植物的抗病性途径中发挥作用。通过染色体免疫共沉淀分析及WRKY28和WRKY46的过表达试验证明两者都导致拟南芥原生质体ICS1表达增加。基础防御反应的诱导始于病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的检测，激活的黄酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS）受体触发MAP激酶级联反应（MAPKKK/MEKK1，MKK4/5，MPK3/6），从而导致WRKY28基因的转录激活，且WRKY28在电泳迁移率分析试验中与ICS1启动子结合［32］（图2）。也有研究表明，效应子诱导的ICS1表达主要取决于WRKY8和WRKY48，但其是否直接调节ICS1尚不清楚。2017年，Guo等［33］发现另一个转录因子WRKY75直接与ICS1的启动子结合，并在衰老过程中促进了ICS1的表达和SA的产生（图2）。上述结果表明，许多WRKY转录因子与ICS1表达和SA生物合成的正调控有关。

4 SA合成路径的负向调控

在染色体免疫共沉淀和电泳迁移率试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）分析中，乙烯不敏感型3（ethylene insensitive 3，EIN3）和 类乙 烯不 敏 感 型 1（ethylene insensitive 3 like1，EIL1）均与ICS1启动子区结合，且EIN3和EIL1双基因敲除突变株ICS1表达量和SA水平升高，表明EIN3和EIL1对SA合成具有负调节作用［34］（图2）。研究发现在植物中过表达EIN3蛋白（如用35S强启动子-EIN3质粒转化的ebf1-3 ebf2-3双突变体中）会降低植物的防御能力，增强其易感病性［35］。此外，研究发现ein3-1 eil1-1双突变体中上调的大多数基因是野生型植物中的 PAMP应答基因［36］。这些结果表明，EIN3和EIL1通过抑制PAMP触发的转录程序来负调控抗病性［35］。ein3-1 eil1-1双突变体中的高表达基因是EDS1和PAD，另外SA生物合成基因SID2在此双突变体中也有较高的表达。分析表明，SID2启动子在ein3-1 eil1-1双突变原生质体中具有高活性，证明EIN3和EIL1在转录水平与SID2相互作用调节植物的防御途径［35］。

另一方面，NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，其家族成员N端都含有大约150个氨基酸的NAC结构域。其中 ANAC019、ANAC055和ANAC072通过抑制ICS1的表达和苯甲酸/羧基甲基转移酶1（benzoic acid/salicylic acid carboxyl methyltransferase 1，BSMT1）的激活，在SA合成抑制中发挥作用，同时又可以通过ICS1的转录抑制和SAGT1的转录激活增加SA存储［37］。NAC转录因子突变体的遗传特性表明，这些转录因子通过抑制植物免疫关键信号SA的合成而引起冠状病毒（coronavirus，CoV）诱导的气孔重开以及细菌在植物局部和全身组织中的繁殖［38］。研究发现，这三个基因的启动子区都具有保守的CACGTG G box的富集，由于G box被证明是植物髓细胞组织增生蛋白（myelocytomatosis proteins，MYCs）中转录因子MYC2的结合位点，所以这三个转录因子可能由MYC2调控［39］。染色体免疫共沉淀试验表明，三种NACs通过直接相互作用调节BSMT1和ICS1的表达，且对ICS1有抑制作用［37］。这些证据进一步说明，BSMT1是可以被病原体操纵的植物防御调节点。BSMT1可响应SA水平的增加并将SA转换为水杨酸甲酯（methyl salicylate，MeSA）［39］。因此，冠状素（Coronatine，COR）触发的BSMT1感应能够有效地抑制SA的积累，降低植物防御能力（图2）。

最新研究报道，CAMTA1/2/3对植物免疫基因表达和SA生物合成起负调控作用［40-41］。CAMTA1/2/3功能缺失会诱导类AGD2-防御响应蛋白1（AGD2-like defense response protein 1，ALD1）和黄素依赖性单加氧酶1（flavin-dependent monooxygenase 1，FMO1）表达并促进哌啶酸（pipecolinic acid，Pip）的生物合成。CBP60g是钙调素结合转录激活剂3（calmodulin-binding transcription activator 3，CAMTA3）的直接靶点，并可能通过间接效应负调控SARD1的表达。进一步研究表明，与ald1 fmo1双突变体类似，sard1 cbp60g双突变体抑制了camta3-1的自身免疫，且这两个基因的单突变体（sard1或cbp60g）在N-羟基哌酸（N-hydroxypipecolic acid，NHP）的生物合成中存在缺陷。高Pip含量的camta1/2/3株系的SA含量显著增高，且用Pip外源处理拟南芥会显著诱导包括ICS1及其正调控因子CBP60g、SARD1、PAD4和EDS1基因表达上调，这表明CAMTA1/2/3的功能缺失促进了Pip介导的SA生物合成。在正常植株中，CAMTA1/2/3与CBP60g和SARD1的启动子结合，并抑制这些基因的表达；而在病原体侵染后，CAMTA1/2/3的功能被抑制，CBP60g和SARD1表达量增加，从而诱导ICS1的表达并促进 SA和 Pip的生物合成，最终导致防御基因诱导表达［40-41］。并且SA和NHP合成的通路可以相互放大，CAMTAs通过调节SARD1和CBP60g的表达来抑制SA和NHP的生物合成，SA和NHP的合成通路相互协调进而影响植物免疫（图2）。

CBP60a是另一种与SA生物合成负调控有关的转录因子［42］。在cbp60a突变植物中，基础ICS1和SA水平增加，这表明CBP60a直接或间接影响ICS1和SA的生物合成。两个WRKY转录因子WRKY18和WRKY40直接靶向ICS1、EDS5和PBS3，并负面调节其表达［43］。此外， WRKY70和WRKY54也对SA生物合成的负调控起作用［44］（图2）。WRKY70与SARD1的启动子结合，其功能丧失导致SARD1表达升高，表明它参与抑制基础水平的SARD1表达［45］。两种受体胞浆激酶PCRK1和PCRK2在PTI过程中对SA生物合成的激活起着关键作用［46］。pcrk1 pcrk2双基因敲除突变株对病原感染表现出较强的抗性，即通过降低SARD1、CBP60g和ICS1的表达来降低SA生物合成水平。并且，研究发现PCRK1和PCRK2与鞭毛素受体FLS2相互作用，用不同的PAMP诱导子处理后可使其迅速磷酸化［47］，由此可证明它们参与了PAMP信号的传递［48］。

5 总结与展望

SA在植物系统获得性免疫中发挥着重要的作用，而其主要来源是异分支酸途径。在叶绿体中，CA在ICS的作用下生成IC，再通过定位于叶绿体的EDS5转运蛋白将IC转运至细胞质，通过胞质蛋白PBS3转化为IC-9-Glu加合物，最后自发水解或在EPS1的酶促作用下快速分解形成SA。EDS5蛋白作为叶绿体膜转运蛋白，其转运产物不是SA而是IC，这也说明了异分支酸途径并不全在叶绿体中进行。EPS1在IC-9-Glu快速分解形成SA的过程中发挥着重要的酶促作用，但由于该加合物也可自发水解形成SA，所以EPS1并非不可或缺的组分。同时，在SA的合成途径中，存在多种不同调控因子并控制植物SAR的活性［49］。这些调控因子与SA合成路径中重要的运输蛋白或SA的前体结合，通过促进或抑制其活性，来调节植物中SA的水平，且它们的调控在植物不同的组织系统中有不同程度的作用［50］。通过认识SA的内源合成途径并掌握其相关的正负调控因子的具体调控方式和途径，可以帮助人们更准确地理解SA在植物抗病中的重要调控作用。目前，关于SA生物合成的研究大多集中在拟南芥的ICS途径上，我们还不清楚除了芸苔科之外的植物中，SA的合成途径是否一致。且在另一条途径即PA L通路中，尚未发现催化BA向SA转化的关键酶，我们对该途径是如何调节SA合成的机制也知之甚少［51］。虽然目前已经发现了许多转录因子参与调节SA生物合成基因的表达，但尚不清楚其是如何与上游防御信号成分连接起来的。

此外，不同植物激素存在的高度复杂交互作用，使防御反应对植物生长发育的影响最小化。已知SA依赖性防御信号与茉莉酸（jasmonic acid，JA）/乙烯（ethylene，ET）依赖性防御信号既相互颉颃，但又不完全颉颃，因此SA和JA/ET之间的交互作用机制可能因植物种类和病原菌的不同而不同。脱落酸（abscisic acid， ABA）也负调节SA介导的抗病性，但SA和ABA似乎也可共向调节某些非生物胁迫耐受性反应。另外，SA生物合成增强可能会限制吲哚乙酸的合成，反之亦然。有研究发现，SA可以明显改变土壤（或根际）微生物群落，但土壤浸施SA对植物的影响主要集中于系统免疫诱导反应，而有关SA对植物根际或内生微生物群落的效应知之甚少［52］。因此，未来可研究通过外施植物生长物质或者调节土壤中某些物质的含量，以减少植物体内某些激素的生成从而调节内源性SA合成，也可通过研究土壤中微生物组成分变化对SA含量的改变推断外界微生物环境对SA合成的影响，并进一步揭示其复杂网络与调控机制，从而实现SA对植物抗性的适时诱导与生长发育的精细调控间的综合协调。