姜黄素对LPS诱导的大鼠星形胶质细胞NF-κB炎症因子信号通路的影响

李建设 何文龙 孟珂 付云

(新乡市中心医院 1神经重症监护病房,河南 新乡 453000;2全科医学科)

星形胶质细胞是中枢神经系统胶质细胞的重要组成部分，其表面分布许多神经递质、神经营养因子受体、神经肽、激素及Na+、K+和Ca2+通道等，与神经元相互作用，在免疫调节、信号转导和维持神经系统内外环境稳态等方面发挥重要作用，与系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病和癫痫等多种中枢神经系统性疾病的发生及发展密切相关〔1～3〕。当中枢神经细胞受损时，星形胶质细胞被激活，伴随标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6等分泌增多，对神经元起到保护或毒性作用。因此，探讨星形胶质细胞的活化机制对认识和改善中枢神经系统性疾病具有重要意义。姜黄素是从姜黄属植物姜黄、郁金和莪术等多年生的草本植物中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂和抗肿瘤等多种药理活性〔4，5〕；NF-κB信号通路是与细胞炎症密切相关的转导通路，促炎细胞因子、脂多糖 (LPS)、生长因子及抗原受体等均可激活核因子(NF)-κB，参与细胞免疫、炎症、应激反应、细胞发育和淋巴器官形成等生理过程〔6〕。已有报道证实〔7〕，姜黄素可通过抑制TNF-α诱导的大鼠星形胶质细胞单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达和释放减轻神经病理性痛，对神经系统损伤起到保护作用，但其对星形胶质细胞炎症反应的影响并不清楚。LPS是革兰阴性杆菌胞壁外膜层的重要组分，可诱导炎症因子的释放造成炎症损伤〔8～10〕。本研究构建LPS诱导大鼠星形胶质细胞损伤后的炎症反应模型，观察姜黄素对细胞中NF-κB炎症因子信号通路的影响，以期为预防和改善中枢神经系统性疾病提供新的线索和依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂 出生1～2 d的清洁级SD大鼠购于福建医科大学实验动物中心。DMEM/F12培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，D-Hanks液、Triton、4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、姜黄素、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、蛋白裂解液、LPS、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体和GFAP抗体购于美国Sigma公司，p-p65、p65和GAPDH抗体购于英国Signal cell公司，一氧化氮(NO)检测试剂盒、ECL化学发光剂和二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所，辣根过氧化酶标记的二抗购于北京中杉公司，Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司，荧光素酶报告基因检测系统购于美国Promega公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于武汉博士德公司。

1.2大脑皮层星形胶质细胞的培养与鉴定 采用浓度为75%乙醇对SD大鼠进行消毒。在超净台上取大脑皮层组织。置于含D-Hanks培养液中，剔除脑膜和血管组织。在培养皿中，将组织剪碎(约1 mm3小块)，研磨后，加入0.25%胰蛋白酶消化10～20 min。待细胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，以200目筛网过滤，并以1 000 r/min离心10 min。加入培养基调整浓度约为6×105个/ml。取适量细胞悬液接种至含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶中，置于含5%CO2的37℃恒温培养箱内常规培养。待培养9～12 d后，加入胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞形态。待细胞突触皱缩后，加培养基终止消化。吹打后离心弃上清。加入培养液行差速黏附处理30 min后，以每毫升5×105个细胞接种至培养瓶中。收集第4代细胞，以每孔5×104个细胞接种至96孔板上，常规培养2 d后，以4%多聚甲醛常温固定30 min。经0.2%Triton破膜后，加入1∶1 000倍稀释的GFAP抗体4℃下孵育24 h。再加入1∶100倍稀释的二抗37℃下孵育1 h。最后，加入DAPI(浓度1 μg/ml)37℃下复染10 min。采用荧光显微镜观察并拍照。

1.3MTT检测细胞活性 收集长势良好的大鼠星形胶质细胞，调整细胞浓度为2×105个/ml，以每孔100 μl接种至96孔板上。设置不做药物处理的对照组和不含细胞的空白组。以浓度为100 ng/ml LPS单独处理或联合5、10、20、40、80 μmol/L姜黄素共同作用24 h后，加入5 mg/ml MTT溶液10 μl反应4 h。以DMSO溶解(体积150 μl)蓝紫色晶体后，上酶标仪检测各孔细胞在490 nm处的光密度(A)值。细胞活力(%)=(加药孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。

1.4硝酸还原酶法检测NO含量 将大鼠星形胶质细胞以每孔3×104个接种至12孔细胞板上，常规培养24 h后，浓度为100 ng/ml LPS单独处理或联合5、10、20 μmol/L姜黄素共同作用24 h。收集上清液。参照NO检测试剂盒说明书步骤进行检测。其中以100 ng/ml LPS单独处理下NO含量作为1，采用分光光度计在波长为550 nm比色，观察各组细胞NO相对含量。

1.5Western印迹检测iNOS、p-p65和p65蛋白表达 参照总蛋白提取试剂盒说明书步骤提取待测细胞的总蛋白，并以BCA法对总蛋白定量。将总蛋白上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳分离后，转膜。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h。加入1∶500倍稀释的iNOS、p-p65、p65和GAPDH抗体于4℃下孵育24 h。经封闭液洗涤后，加入1∶5 000倍细胞的二抗于37℃下孵育1 h。暗室内加入ECL化学发光剂显影后，凝胶成像系统扫描分析。

1.6ELISA法检测TNF-α、IL-1β和IL-6含量 收集 LPS单独(100 ng/ml)处理或联合姜黄素(5、10、20 μmol/L)共同作用24 h后的星形胶质细胞，严格参照ELISA检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.7荧光素酶报告基因实验检测NF-κB活性 将构建的NF-κB报告基因质粒参照转染试Lipofectamine 2000使用说明书步骤转染至星型胶质细胞中，分别以不做药物处理的细胞作为LPS(-)+ Cur(-)对照组，以100 ng/ml LPS作用6 h的细胞作为LPS(+)+Cur(-)组，以5、10、20 μmol/L姜黄素预处理1 h后，再给予100 ng/ml LPS作用6 h的细胞作为LPS(+)+Cur(+)组。加入细胞裂解液提取总蛋白后，取适量总蛋白加入检测试剂后，上机检测，将LPS(+)+Cur(-)组细胞荧光素酶活性作为1，计算各组细胞的荧光素酶活性。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验及t检验。

2 结 果

2.1大脑皮层星形胶质细胞的鉴定结果 首次接种的星形胶质细胞在2～3 d完全贴壁，折光性较好，部分细胞开始铺展，甚至长出细长的胞突，可见胞体成多角形，个别细胞核呈圆形或卵圆形，有些胞体向四周发出几个放射状突起。10 d左右可长满，主要以星形胶质细胞为主，还含有少量的少突胶质细胞和极少量的成纤维细胞。传代后细胞保持原状态，但生长更活跃，培养4 d左右细胞可铺满瓶底。显微镜下细胞胞质较丰富，突起增多，胞核常偏于一侧，多为椭圆形。培养的星形胶质细胞在未长满至前，细胞形态似成纤维细胞样，形态不一，扁平状，细胞长满后汇合形成均一的铺路石样外观。星形胶质细胞传代到第4代时应用GFAP抗体免疫荧光鉴定培养的细胞，阳性细胞染成绿色，细胞核呈蓝色，阳性率达到95%以上，证实绝大多数细胞为星形胶质细胞。见图1。

图1 星形胶质细胞的鉴定结果(×400)

2.2姜黄素和LPS对大鼠星形胶质细胞活性的影响 与对照(无任何药物作用)组(97.78%±2.78%)相比，100 ng/ml LPS单独作用(96.70%±3.24%)与姜黄素5、10、20 μmol/L共同作用后星形胶质细胞的活力(96.34%±2.53%、95.78%±3.08%、95.57%±3.16%)无显著变化(P>0.05)，而姜黄素40、80 μmol/L 与LPS共同作用后细胞活力(65.25%±1.99%、22.02%±1.11%)较对照组显著降低(P<0.05)。实验结果表明，姜黄素浓度低于40 μmol/L时，对于星形胶质细胞活力无显著影响。故后续实验研究采用5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素对细胞进行干预。

2.3姜黄素对LPS诱导NO 生成和iNOS表达的抑制作用 给予100 ng/ml LPS单独作用24 h后，星形胶质细胞中NO含量和iNOS蛋白表达(0.99±0.07、0.93±0.07)较对照组(0.32±0.03、0.09±0.01)明显升高(P<0.05)；给予5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素处理后，细胞中NO含量和iNOS蛋白表达(0.74±0.04、0.72±0.05，0.55±0.03、0.53±0.04，0.41±0.02、0.26±0.02)较100 ng/ml LPS单独处理组明显降低(P<0.05)，且呈浓度依赖性。见图2。

图2 Western印迹检测iNOS蛋白表达

2.4姜黄素对LPS诱导的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的抑制作用 与对照组相比，给予100 ng/ml LPS单独作用后，星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显升高(P<0.05)；与100 ng/ml LPS单独处理组相比，给予5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素处理后，TNF-α、IF-1β、IF-6含量均呈浓度依赖性明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 姜黄素对LPS诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6的影响

2.5姜黄素对LPS诱导的NF-κB信号通路活化的抑制作用 给予100 ng/ml LPS单独作用后，星形胶质细胞中p-p65/p65比值和NF-κB活性(0.95±0.09、0.98±0.07)较对照组(0.08±0.01、0.05±0.01)明显升高(P<0.05)；而给予5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素处理后，细胞中p-p65/p65比值(0.72±0.07、0.37±0.03、0.16±0.01)和NF-κB活性(0.75±0.05、0.53±0.04、0.23±0.02)明显依次降低，与100 ng/ml LPS组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 Western印迹检测p-p65和p65蛋白表达

3 讨 论

在炎症环境下，星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥免疫细胞的作用，可通过产生和释放TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎反应调节因子促进炎症反应，加重神经细胞损伤；另外，激活的星形胶质细胞可大量表达iNOS，产生大量的NO，对神经元起到毒性作用〔11～13〕。因此，探讨星形胶质细胞的活化及炎症机制，减轻其炎症反应对认识和治疗中枢神经系统性疾病具有重要意义。姜黄素是一种天然的酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等药理作用，且毒性小和不良反应小，可通过调控多种基因或信号通路的表达发挥抗炎作用。Nakatake等〔14〕发现，姜黄素可通过抑制肝细胞NF-κB活化影响炎症介质iNOS、IL-6、TNF-α的表达，被认为具有治疗器官损伤的潜力。Zhang等〔15〕指出，姜黄素可通过抑制外伤性脊髓损伤诱导的炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，抑制TAK1和NF-κB通路活化，减轻脊髓损伤。本研究结果提示，姜黄素可通过抑制炎症反应参与神经系统损伤的保护机制。

NF-κB是细胞内重要的转录因子，参与细胞的免疫、炎症、应激反应、细胞发育和淋巴器官形成等生理过程；p65是其5个亚单位(Rel、RelB、p52、p50和p65)之一；正常情况下，p65可与抑制蛋白IκB结合形成复合物，以无活性形式存在于胞质中；但当受到细胞外信号如LPS刺激时，IκB蛋白降解，p65被磷酸化(p-p65)，NF-κB激活，p-p65/p65比值可间接反映NF-κB通路激活程度〔16〕。研究〔17～19〕已证实，被LPS诱导活化的NF-κB可通过促进炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达，同时还可启动iNOS转录，促进iNOS表达，产生NO。可见，活化的NF-κB可通过调控炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的产生促进炎症进展。Tsubaki等〔20〕和Cao等〔21〕证实，抑制或阻断NF-κB活化可下调细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和NO表达，减弱炎症，改善组织损伤。曹念等〔22〕研究指出，姜黄素可通过抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应，发挥改善慢性阻塞性肺疾病肺病理损伤的作用。为了进一步探讨姜黄素保护神经系统损伤的分子机制，本文通过荧光素酶报告基因实验检测，结果提示姜黄素可通过抑制NF-κB介导的炎症反应发挥保护神经系统损伤的作用。