紧密连接对肺通透性影响的研究进展

武 勰，晏馥霞

(中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外医院 麻醉中心，北京 100037)

肺通透性受损是各种类型肺损伤的一个重要的病理改变，此时大量富含蛋白的水肿液渗出，引起肺水肿和低氧血症，在胸片上表现为不同程度的肺部浸润。肺正常通透性的维持依靠细胞形态、细胞间紧密连接(tight junctions，TJs)以及细胞与细胞外基质间黏附的动态调控，是细胞内外多种效应分子关联的结果，其中TJs是相邻内皮细胞彼此连接成细胞单层的重要组成部分。TJs位于相邻细胞之间直接接触的部位，它们共同作用来调控血管内皮和肺泡上皮的通透性。因此，本文就TJs对肺通透性影响的相关研究做一简要综述。

1 肺的通透性

肺泡是气体交换的场所，从肺泡到血管至少需要通过两层细胞，即肺泡上皮和肺血管内皮，并构成肺泡-毛细血管屏障。在正常肺组织中，液体和少量蛋白质会通过毛细血管内皮细胞之间的小间隙从血管内传递至组织间隙，然后再由淋巴管回流到全身循环。由于肺泡上皮的紧密性，液体和溶质在正常情况下不会进入肺泡。但当肺泡上皮和肺微血管内皮屏障受损时，液体及蛋白质等则会从血管转移至肺间质继而进入肺泡造成肺水肿，因此有人把血管内皮屏障称为阻止肺水肿形成的第一屏障, 而把肺泡上皮屏障称为第二屏障。无论是肺血管内皮屏障或是肺泡上皮屏障，都是影响肺通透性改变的关键因素。

1.1 肺血管内皮屏障

肺血管内皮屏障主要由肺微血管内皮细胞汇合而成，对于肺组织的通透性至关重要，其主要功能有以下两点，一方面它需要最大程度的减少血浆蛋白和血细胞向肺间质的渗漏，从而防止在正常血管压力下出现威胁生命的肺泡充血；此外，还需要通过内皮屏障来进行液体、电解质及营养物质的交换。内皮细胞是微血管壁内液体和溶质通过的主要屏障，物质交换的主要途径有两种：细胞旁途径和跨细胞途径。通常认为液体和大多数溶质通过肺微血管壁采取细胞旁途径，相对较大的溶质(如大分子等)的运输途径则存在争议，尤其是在炎性反应出现的情况下，更有可能是通过跨细胞途径。所有邻近的血管内皮细胞彼此紧密相连形成血管内皮屏障，并维持了正常肺组织中较低的细胞旁通透性。没有完整的内皮屏障，肺就不能维持肺泡气体和毛细血管血液的严格分离，而这是正常气体交换所必需的[1]。因此，内皮细胞间连接的稳定性和强度变得非常重要。屏障的稳定性与内皮细胞间黏附、内皮细胞与基底膜的牢固附着以及内皮细胞的形状等都密切相关，而所有这些都离不开细胞的TJs。

1.2 肺泡上皮屏障

肺泡上皮屏障主要由肺泡上皮细胞组成，其主要功能是将充满气体的肺泡腔与肺间质液体隔开，此外，肺泡上皮还要参与不同腔隙之间的物质转换[2]。健康的肺泡中，肺泡上皮是一个极其紧密的屏障，会限制水、电解质及亲水性的小溶质进入到肺泡腔。当心源性功能障碍或容量超负荷等导致肺水肿时，水肿液会在肺泡腔中聚集，此时机体会通过顶膜上皮钠离子通道(epithelial sodium channel，ENaC)主动运输钠离子，形成跨上皮渗透梯度，使水肿液被动地从肺泡腔移向肺间质，从而清除多余液体。肺泡上皮损伤是促进肺通透性增加的关键因素。肺泡上皮损伤的潜在机制包括细胞死亡/凋亡、细胞间TJs的受损、细胞外基质成分及其与上皮细胞间接触的变化，以及上皮细胞与炎性细胞间的相互作用等，这些因素都可以通过机械拉伸、炎性反应失调、白细胞和血小板的过分激活以及微血栓形成时促凝信号的增强来加重肺损伤的程度[3]。其中，影响肺通透性和肺泡清除能力的最主要因素则是TJs的受损。

2 紧密连接

TJs是细胞黏附的重要组成部分，对于肺通透性的调节起到关键作用。TJs是黏附在相邻细胞脂质膜上的蛋白复合物，在上皮细胞间与内皮细胞间均存在，主要具有栅栏和屏障功能。TJs阻止细胞膜中的脂质和蛋白质等的自由流动，将内皮和上皮细胞膜划分成基底膜和顶膜两部分，参与维持细胞极性，完成栅栏功能；通过调控水、电解质及小分子溶质的细胞旁转运来完成屏障功能。TJs主要包括跨膜蛋白和胞质蛋白：跨膜蛋白包括闭合蛋白家族(occludin)、密封蛋白家族(claudin)和连接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)等，其主要通过在细胞外环相互融合，使细胞间形成紧密连接；胞质蛋白包含ZO蛋白家族和cingulin，它会和细胞内衔接蛋白连接并最终与骨架蛋白中的肌动蛋白(F-actin)结合形成紧密连接网络，在上皮细胞和内皮细胞顶端及基底外侧区域防止溶质自由出入(图1)。

图1 紧密连接结构示意图Fig 1 Diagram of tight junctions

2.1 跨膜蛋白

2.1.1 闭合蛋白：闭合蛋白是TJs中发现的第一个蛋白。其分子质量为65 ku，有两个细胞外环和两个剪接变异，是首个被认为与TJs形成和肺通透性有关的蛋白，也是维持肺泡上皮屏障的重要组成部分。闭合蛋白胞外结构域将其与其他TJs连接，并在一定程度上影响肺的紧密连接和肺的通透性[4]。有研究表明，机械通气引起的急性肺水肿肺损伤是由于闭合蛋白表达降低、TJs的降解、肺泡屏障完整性破坏以及肺泡上皮通透性增加所致，并且可以通过上调闭合蛋白减少机械通气所致肺损伤。然而，缺乏闭合蛋白的胚胎干细胞能够形成紧密连接结构；细胞模型中敲低闭合蛋白不会影响跨上皮电阻，并且在内皮细胞中不会产生通透性表型；在小鼠模型中敲除闭合蛋白也没有影响细胞旁通透性，这表明闭合蛋白不是形成TJs所必需的成分，它的缺失可以由其他蛋白代偿[5]。

2.1.2 密封蛋白家族：密封蛋白是一个由27个跨膜蛋白组成的家族，是紧密连接屏障中调节溶质在极化上皮细胞间移动的关键部分。密封蛋白家族成员彼此相互作用，也与其他跨膜紧密连接蛋白(如闭合蛋白)和胞质支架蛋白(如Zonula occluden 1，ZO-1)相互作用。尽管所有种类蛋白质之间的相互作用对于TJs的形成和功能都很重要，但密封蛋白家族蛋白质直接参与形成具有特定渗透性的细胞旁离子的选择性通道，因此在参与屏障功能的众多蛋白中最为重要[6]。密封蛋白是由4个跨膜结构域、两个胞外环、一个短的胞质N端和一个较长的胞质C端组成的蛋白质，分子质量为20～27 ku。根据密封蛋白的功能不同可将其分为两个亚类:1)通过形成细胞旁通道而增加细胞旁通透性的密封蛋白;2)降低细胞旁通透性的密封蛋白。前者包括密封蛋白-2、-7、-10、-15、-16等，而后者研究较多的有密封蛋白-1、-3、-5、-11、-19等[7]。密封蛋白的表达在不同组织中会差异表达，在肺中倾向于降低细胞旁通透性，已知研究中明确在肺部表达的有密封蛋白-1、-3、-4、-5、-7和-18[8]。

密封蛋白-1可以调节相邻的上皮细胞之间的细胞黏附，并参与调节细胞迁移，当密封蛋白-1表达量降低时TER降低，肺通透性也随之升高；此外，有研究敲除小鼠的密封蛋白-1基因，发现小鼠会死于严重的屏障损害[9]。密封蛋白-3在其他组织中的研究表明它可降低细胞旁通透性，但在肺泡上皮细胞中却发现其会使细胞旁通透性增加，同时会降低密封蛋白-4的密封作用[10]。人类和小鼠的肺中，密封蛋白-4的高表达会导致肺泡清除率增高，这提示密封蛋白-4具有肺保护或促进肺修复作用，这可能是因为密封蛋白-4形成了限制钠电导的高阻连接，导致了更大的跨上皮钠梯度[11]。密封蛋白-5是内皮细胞TJs中主要的跨膜蛋白，但敲除该基因并未在肺血管中产生通透性表型；健康肺泡上皮中密封蛋白-5表达量较低，且肺上皮细胞旁通透性会随密封蛋白-5表达的增加而增加[8]。密封蛋白-7在不同细胞中对紧密连接的作用不尽相同。小鼠敲除密封蛋白-7会损伤肾脏重吸收能力并导致慢性脱水，这表明密封蛋白-7在跨上皮离子运输中起关键作用，但目前为止尚未发现敲除后会出现肺部表型[12]。密封蛋白-18是唯一已知的肺特异性TJs，并且是1型肺泡上皮细胞中表达最丰富的密封蛋白，它在肺泡上皮细胞中提供了一个大分子的通透性屏障，细胞实验证实密封蛋白-18缺失时会导致肺泡内环境的紊乱并使肺泡受损，但密封蛋白-18 敲除的小鼠并没有发展成肺水肿，这可能与动物模型中Na+/K+-ATP酶的过表达导致较高的肺泡清除能力有关，但也有报道敲除密封蛋白-18后小鼠会出现肺癌表型[13-14]。

2.2 胞质蛋白

胞质蛋白有闭锁小带蛋白(如ZO家族)和扣带蛋白(cingulin)等，在紧密连接中主要起到防止溶质在细胞顶端和基底外侧自由出入的作用。在肺通透性中研究最多的是ZO家族中的ZO-1。ZO-1相对分子质量为210 ～ 225 ku，有1个长的羧基末尾区域和富含脯氨酸结构域的酸性模块，几个选择性剪接点。在紧密连接网络的构成中，ZO-1主要是通过与其同源体的ZO-2和ZO-3相结合，为跨膜蛋白和胞质蛋白搭建具备衔接作用的“脚手架样平台”。

ZO-1作为一种支架蛋白，连接TJs中跨膜蛋白与肌动蛋白细胞骨架，是影响肺部屏障结构和功能的重要因素。肌动蛋白和肌球蛋白是构成细胞骨架的两种主要成分，它们相互作用调节细胞的张力和收缩，这也会影响上皮的通透性。这些蛋白在紧密连接复合物中的表达、定位和组装以及它们与细胞骨架肌动蛋白纤维的相互作用的改变会导致紧密连接的功能障碍，从而增加细胞旁通透性，因此常以ZO-1作为评价细胞间屏障功能的主要指标[15]。此外，ZO-1还通过招募刺激物质来刺激肌动蛋白聚合，构建皮质肌动蛋白环，并通过与皮质肌动蛋白环的结合，增强TJs的稳定性，减少肺的通透性[16]。

3 前景与展望

目前，急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的治疗措施主要包括治疗原发病、呼吸支持治疗、液体管理以及糖皮质激素等。针对性的通过调节TJs来改善肺通透性，从而从根本上治疗ALI，是未来可能的一个治疗方向。有动物研究表明，去乙酰化酶-1(SIRT-1)通过上调多种TJs的表达来减少肺血管内皮的渗漏，从而减轻ALI程度[17]；异氟烷通过抑制ALI时ZO-1的降低改善肺泡毛细血管屏障，减少呼吸机相关性肺损伤的发生[18]；乌司他丁也可以通过保护TJs来减少脓毒症时肺微血管内皮的通透性，从而减轻ALI[19]。

总之，肺通透性改变是肺损伤时重要的病理改变之一。通过改变TJs来调控肺的通透性，从而减轻患者的肺损伤，则为肺损伤的治疗提供了一个新的思路。阐述TJs在肺通透性的影响将有助于对这一问题的深入理解，相信随着研究的不断深入，通过加强TJs来改善肺的通透性将有望成为肺损伤治疗的重要举措之一。