青稞酥油饮食对小鼠肠道菌群以及葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎症状的影响

李春美，赵 微，解相宏，张伟虹，杨佳卉，李 军，刘晓军*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005；2.山西医科大学 基础医学院 微生物学与免疫学教研室，山西 太原 030001；3.北京大学第三医院 消化科, 北京 100191)

肠道微生物在调节多种慢性疾病发病中发挥重要作用，同时饮食也参与到微生物的形成中，饮食的改变可在短时间内引起微生物组成的变化。鉴于这种联系，通过饮食改变微生物组成可能具有显著的治疗作用[1-2]。青稞和酥油是藏族饮食结构的重要组成成分，被认为是一种高纤维、健康绿色的饮食，具有抗感染和减脂的作用[3]。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种由肠道微生物和肠道免疫系统相互作用异常而引发的慢性胃肠道炎性反应[4]，其中饮食被认为是导致肠道微生态改变的重要因素之一[5]。肠道微生物菌群的紊乱，导致肠道生态失衡，表现为肠道上皮黏膜屏障遭到破坏，炎性细胞浸润[6]。已报道改善饮食习惯可改变肠道微生物菌群结构，从而修复破损的黏膜组织，对结肠炎可达到很好的治疗效果[7]。

然而，对于青稞酥油饮食在溃疡性结肠炎和肠道菌群中的作用并不明确。本研究利用经典葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性溃疡性结肠炎动物模型，以探究青稞酥油饮食结构对其炎性反应及肠道微生物结构变化的影响，为结肠炎的治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物： 5周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠[中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心，生产许可证号SCXK(京)2019-0010]，饲养环境清洁级。

1.1.2 试剂：分子质量为36～50 ku的葡聚糖硫酸钠DSS(MP Biomedicals购)、便隐血试纸(BA2020B珠海贝索生物技术有限公司购)；鼠繁殖料1035(简称N鼠料)、定制饲料[将N鼠料配方中脂肪源(2%大豆油)等比例替换为酥油，碳水化合物(53.76% 玉米、次粉)等比例替换为生青稞粉，其余成分及比例保持不变，简称C鼠料](北京华阜康生物科技股份有限公司购)；生青稞粉(西藏七芝堂实业有限公司购)、酥油(西藏拉萨本地农户家里)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：上述实验小鼠(n=28)随机分为4组，每组7只，在未饮用DSS前用各自对应鼠粮饲养5周，之后分组建模如下： 1)NW组：饲养以N鼠料与正常饮水；2)ND组：饲养以N鼠料与1.8% DSS溶液；3)CW组：饲养以C鼠料与正常饮水；4)CD组：饲养以C鼠料与1.8% DSS溶液。

1.2.2 DSS诱导UC模型：造模组小鼠自由饮用1.8% DSS 7 d，换蒸馏水饮用10 d，此为1个周期，共进行3个周期。在第3周期结束前5 d处死小鼠，整个造模期间，其余两组均自由饮用蒸馏水。

1.2.3 小鼠疾病活动指数评分：记录小鼠体质量、粪便成形、便隐血情况，参考评分标准(表1),“DAI=( weight loss+ stool consistency+ blood)/3”[8];匹拉米洞试纸法，根据显色时间进行评分。

1.2.4 结肠组织长度及病理形态：分离小鼠结肠，拍照记录形态；剪下小鼠结肠中段，蒸馏水冲洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，进行常规HE染色，并在普通光镜下观察黏膜炎性反应情况。

1.2.5 粪便采集及指标检测：处死前收集新鲜粪便，迅速放入液氮中保存。提取各组粪便样品中细菌总DNA, 根据16S rRNA V4区设计引物进行扩增测序, 利用生物信息学对测序结果进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 青稞酥油饲料对小鼠体质量的影响

实验期间NW组和CW组体质量变化无差异，定制鼠料可满足其营养需求； ND组和CD组在适应性饲养期间体质量无差异，但第八周(建模第一个周期)CD组体质量低于ND组(P<0.05)(图1)。

2.2 小鼠DAI的评分

对各组小鼠进行疾病活动指数评分，建模第一周期中CD组平均得分显著大于ND组(P<0.05)，表明肠炎更严重，这与第一周期的体质量变化情况相一致；建模完成后，CD组死亡率42.9%，ND组为14.3%(表2)。

2.3 小鼠结肠形态及HE染色

NW组和CW组小鼠结肠褶皱比较清晰，肠体颜色为粉红；ND组小鼠肠壁褶皱变浅，轻微水肿，充血；CD组小鼠肠组织颜色暗红，充血明显，溃疡并伴有局部坏死。NW组和CW组肠组织完整，腺体排列整齐，无明显炎性反应；ND组黏膜层有糜烂；CD组小鼠肠组织腺体排列混乱，结肠黏膜糜烂溃疡(图2，3)。

*P<0.05 compared with ND group图1 建模期间小鼠体质量变化Fig 1 Change of body weight during the

表2 各组小鼠疾病活动指数

图2 小鼠结肠形态观察Fig 2 The morphology of mouse colon

2.4 小鼠结肠菌群多样性的分析

α多样性(alpha diversity)是对单个样品中物种多样性的分析。 observed species指数、Chao指数反映群落中丰富度，Shannon指数反映群落多样性，数值越大，物种丰度和多样性越高。青稞酥油饮食可提高正常小鼠肠道菌群物种总数和多样性，经过1.8% DSS诱导后，小鼠肠道菌群的物种总数降低，青稞酥油组降低明显(图4)。

2.5 肠道菌群物种注释及差异分析

NW组肠道菌群属水平主要构成为普雷沃菌属(Prevotella)、阿克曼菌属(Akkermansia)、颤螺菌属(Oscillospira)；ND组属水平主要构成为普雷沃菌属、拟杆菌属(Bacteroides)、埃希氏杆菌属(Escherichia)；CW组属组成主要构成为颤螺菌属、普雷沃菌属、别样棒菌属(Allobaculum)；CD组属水平主要构成为拟杆菌属、埃希氏杆菌属、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、萨特氏菌属(Sutterella)。青稞酥油饮食改变了正常小鼠肠道菌群组成，普雷沃菌属、别样棒菌属增加；加入DSS诱导溃疡性结肠炎模型后，梭状芽孢杆菌属、萨特氏菌属增加(图5)。

2.6 LefSe分析

LefSe分析设置显示LDA score 大于预设值3.5的显著差异物种，即具有统计学差异的生物标志物。LDA柱形图可以直观看出，在属水平上，NW组显著性最高的是普雷沃菌属(Prevotella)、阿克曼菌属(Akkermansia)；ND组显著性最高的为苏黎世杆菌属(Turicibacter)；CW组显著性最高的为颤螺菌属(Oscillospira)、别样棒菌属(Allobaculum)；CD组显著性最高的为拟杆菌属(Bacteroides)、埃希氏菌属(Escherichia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(图6)。

图3 小鼠结肠组织HE染色Fig 3 HE staining of mouse colon tissue

图4 青稞酥油饮食对DSS诱导的UC小鼠肠道菌群多样性的影响

图5 青稞酥油饮食对DSS诱导慢性UC小鼠肠道菌群的影响Fig 5 Effect of barley plus butter dietary on intestinal microflora in DSS-induced chronic UC mice

图6 LefSe统计比较各组间差异菌属Fig 6 Comparison of difference among groups by LefSe

3 讨论

肠道微生物群是由多种专性和兼性厌氧微生物组成，其可影响宿主代谢和免疫稳态[9]。而肠性疾病与饮食结构和肠道微生态有着密切的关系。本研究探究青稞酥油饮食对DSS诱导的慢性溃疡性结肠炎模型在体质量、活动指标、结肠形态、肠道微生物多样性等方面的影响，可初步得出定制青稞酥油饮食可提高正常小鼠肠道菌群物种丰度和多样性，增加有益菌群别样杆菌数量，改善肠道微生物结构；对于DSS诱导的溃疡性结肠炎无明显改善，但数量增加的促炎菌群梭状芽孢杆菌属和萨特氏菌属对诊断和治疗慢性溃疡性结肠炎可提供一定的依据。

别样杆菌作为一种有益菌群可富集产生短链脂肪酸(SCFA)，其产生的SCFA可与肠黏膜、免疫细胞等细胞广泛表达的G蛋白偶联受体41(GRP41)和GRP43结合，进而诱导细胞分泌高血糖素样肽(GLP-1)和胃肠激素肽YY(PYY)来影响宿主能量物质的代谢，此外在治疗肥胖和相关代谢疾病时其可能通过减少进入血液的肠道内毒素而有助于减轻炎性反应及胰岛素抵抗等[10]，而在中重度寻常痤疮患者肠道中该菌群显著减少[11]，且在氧化偶氮甲烷诱导的小鼠肠炎模型中，通过益生菌的治疗别样杆菌属明显增加，缓解了肠炎症状[12]。

青稞酥油饮食DSS干预组中显著增加的梭状芽胞杆菌属被列为厚壁菌门和梭状芽孢杆菌纲的一个属，在肠道中广泛存在，其中艰难梭状芽孢杆菌在溃疡性结肠炎患者肠道中显著增加，患者平均白蛋白较低，病理学归因为它们产生毒素A和B破环肠道黏膜完整性[13-14]。但对于青稞酥油饮食如何增加正常小鼠肠道中有益菌群，在DSS干预后加重慢性溃疡性结肠炎，其相关机制还需进一步探究。