斑马鱼在急性肾损伤研究中的应用进展

2021-03-05马田田施潇潇陈丽萌

基础医学与临床 2021年2期

马田田，施潇潇，陈丽萌*

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院 1.肾内科; 2.疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京 100730)

急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是临床常见的急危重症，主要表现为短期内肾功能的快速下降及代谢废物的蓄积。AKI 防治形势严峻，住院人群AKI发病率约为21%[1]，是慢性肾脏病和死亡的独立危险因素，因此研究AKI的发病机制有重要的现实意义。经典的啮齿类基因敲除模式动物长期以来广泛用于AKI研究，但存在周期偏长、费用较高、效率偏低等不足，并且难以在活体动物中直接观察肾脏结构和病变。而斑马鱼与其他脊椎动物相比，具有产卵量大、胚胎易得、发育周期短、透明便于体外观察等优势，近年来广泛用于先天性肾脏和尿路畸形[2]、多囊肾[3]和AKI[4-6]等多种肾脏疾病模型的研究。斑马鱼基因功能的遗传学研究方法如利用吗啉代寡聚核糖核酸(morpholinos, MOs)或CRISPR

(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9核酸酶技术进行基因敲低、基因敲除、基因拯救和过表达等，进一步观察斑马鱼的肾脏疾病表型，同样很有前景。目前，国内外已建立起斑马鱼作为AKI模型的诸多研究方法，斑马鱼作为一种新的模式生物有望在AKI的病理生理及分子机制等方面提供更多信息。本文将简述斑马鱼肾脏的结构和功能、斑马鱼AKI模型建立方法以及在AKI研究中的应用优势。

1 斑马鱼肾脏的结构和功能

斑马鱼有幼鱼和成鱼阶段，其肾脏发育也经历前肾和中肾两个阶段。斑马鱼的前肾在结构、细胞类型和功能上都与哺乳动物的肾脏极为相似[7](图1)。在斑马鱼胚胎受精后12 h(12 hours post-fertilization, 12 hpf)，部分中胚层细胞开始向肾组织分化，这标志着前肾发育的开始。12～19 hpf解剖意义上的肾小管节段已经形成，完整的前肾肾单位变得清晰，但只有在肾小管各节段表达标志性的离子通道蛋白或转运子时，肾单位才具有发挥功能的基础。40～48 hpf，肾小球具有滤过功能，在此之后可以实现各种以斑马鱼为动物模型的肾脏研究。

成鱼肾脏也可以用来模拟晚期发育阶段的人类肾脏，作为研究影响成熟组织的肾脏疾病模型[8]。在受精后12～14 d(12～14 days post-fertilization, 12～14 dpf)，中肾开始发育，新的肾单位不断形成。当中肾发育完成时，斑马鱼的肾单位呈更加复杂的分枝状排列，但是节段组成仍与前肾相似。虽然在解剖学上很复杂，但中肾与啮齿类动物的成熟肾脏相比，已经相对容易观察和分析。

2 斑马鱼AKI模型的建立方法

利用啮齿类模式动物研究AKI存在很多限制，如周期长、费用高、效率低以及在活体中实时观察肾脏损伤及修复的发生过程极为困难。随着斑马鱼越来越多地被用于研究AKI，研究者们已经拥有一系列技术手段来研究肾脏损伤及修复，如基因编辑工具及肾脏成像方法等。大多数啮齿类动物经典的AKI模型均可以在斑马鱼中成功建立(表1)。

2.1 药物引起的AKI

庆大霉素是常用的氨基糖苷类抗生素，是治疗细菌感染尤其是革兰阴性菌感染的有效药物，但其临床应用受限于其肾毒性。利用斑马鱼胚胎研究庆大霉素诱导的AKI，注射庆大霉素后，斑马鱼发生了心包水肿、肾小管刷状缘纤毛倒伏、小管腔和小球扩张等类似于AKI的现象[9]。

顺铂是一种细胞非特异性化疗药物，抗瘤谱广，临床用于头颈部鳞癌、肺癌、卵巢癌和睾丸癌等疾病的治疗。顺铂的肾毒性存在剂量依赖，可以在肾脏聚集导致小管上皮细胞凋亡甚至坏死。斑马鱼在被注射顺铂后发生了水肿、细胞内空泡形成、刷状缘纤毛倒伏或丢失、肾小管管腔扩张、小管上皮细胞变矮等现象[9]。使用普罗匹定碘标记凋亡细胞，在注射顺铂2 d后，凋亡细胞增多并释放出线粒体蛋白Omi/HtrA2，这是一种丝氨酸蛋白酶，当其进入细胞质时就会触发多条凋亡通路[10]。将顺铂与Ucf-101(Omi/HtrA2抑制剂)共同注射入斑马鱼心脏静脉窦，相较于只注射顺铂的对照组，斑马鱼的水肿得到改善、存活率也更高[10]。这些研究为发现有效的AKI治疗药物建立了基础。

图1 斑马鱼胚胎前肾结构(背侧观)Fig 1 Diagram of the pronephros in a zebrafish embryo in a dorsal view

表1 斑马鱼急性肾损伤模型建立方法Table 1 Methods for making AKI models in zebrafish

2.2 缺血再灌注损伤AKI

斑马鱼缺血再灌注损伤模型，可以用镊子造成斑马鱼肾小管的机械性梗阻，进而发生AKI。这种斑马鱼肾小管的机械性梗阻会导致小管上皮高表达foxj1(一种转录因子，与纤毛的结构和功能有关)，且仅局限于损伤部位[11]。在小管损伤部位，纤毛摆动频率增加，这可能是梗阻后的代偿。这项研究表明纤毛不仅与维持小管上皮细胞自稳密切相关，而且在小管的损伤后修复过程中也发挥着重要的作用。

2.3 脓毒血症相关AKI

脓毒血症相关的多脏器功能障碍是ICU患者死亡的主要原因[12]。尽管该领域有大量临床和基础研究，与脓毒症相关的急性肾损伤(sepsis-associated acute kidney injury, S-AKI)机制仍不清楚。

利用显微注射将不同浓度的迟缓爱德华氏菌注入斑马鱼体内，其中幼鱼(78～82 hpf)注射入心脏静脉窦，成鱼行腹腔注射，观察7 d死亡率。当接种物达6×106个菌落集成单位(colony-forming units, CFU)时，成鱼死亡率为20%，接种物为300 CFU时，幼鱼死亡率超过50%。AKI标志物的表达如胰岛素样生长因子结合蛋白7、金属蛋白酶组织抑制剂2、肾损伤分子1在S-AKI组斑马鱼的肾小管中都显著升高[13]。

2.4 激光消融引起的AKI

药物诱导斑马鱼AKI模型的缺点是损伤范围广泛，斑马鱼死亡率高。而激光消融可以实现某段肾小管的精准损毁，定点损伤单侧小管，将对侧小管作为对照[14]。

3 斑马鱼在AKI研究中的优势

3.1 药物高通量筛选

为筛选AKI后增强肾脏修复的药物，假设促进肾祖细胞增殖的化合物也会促进肾脏修复，对约2 000种化合物进行了筛选，最终发现4-苯硫基丁酸(4-phenylthio butanoic acid，4-PTBA)可以促进肾脏再生标志物(如lhx1a、pax2a和pax8)的表达，其作用依赖于视黄醛通路[15]。

3.2 肾脏再生研究

斑马鱼是观察AKI后快速修复与再生的良好模型，在经历庆大霉素诱导的AKI后，斑马鱼肾脏的细胞死亡和再生过程同时发生。在损伤后的第1天，斑马鱼近端小管广泛受损，包括基底膜剥离、小管腔内细胞碎片聚集、scl20ala(近端小管标志物)表达消失等。第3天时，表达scl20ala的嗜碱性囊泡开始出现，第5天之前在肾脏可以观察到盘曲的结构。在第7～10天，这些小而盘曲的结构开始伸长进而形成肾小管，这也标志着肾单位的产生。第14天时，实验组斑马鱼与野生型相比scl20ala的表达已无明显差异[16]。这一严格按照时间进程进行的观察为实时研究肾脏再生提供了重要手段(图2)。

3.3 遗传学研究

作为一种具有很多不可替代优点的模式脊椎动物，斑马鱼特别适合于进行大规模、高通量以及涉及数量遗传学的相关研究。通常的遗传学研究方法包括针对特定基因的敲除/敲低、拯救和过表达等。

MOs是一种商业化产品，其基本结构是使用吗啉集团代替DNA结构中的核糖基，合成一段通常长为25个核苷酸的寡聚反义序列。这样的小分子片段能够与相应互补序列的RNA结合，从而阻止基因的表达[17]。吗啉集团能够抵御核糖核酸酶的催化降解，可在生物体内长期行使功能。

MOs敲低是在斑马鱼中产生疾病模型的有效方法，然而，“敲低”允许一些转录本依然可以成功翻译为功能蛋白。为了建立基因敲除模型，即完全消除目的基因的表达，斑马鱼研究人员必须借助基因编辑。近年来，一种新型的基因组修饰技术CRISPR/Cas9受到人们的高度重视。CRISPR是细菌用来抵御病毒侵袭、躲避哺乳动物免疫反应的基因系统[18]。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基互补配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导CRISPR相关蛋白(Cas9)在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA，形成双链DNA切口，然后细胞通过同源重组机制或非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复。科学家们充分利用了这一来源于细菌的免疫系统对很多模式生物进行了基因编辑，比如斑马鱼[19-21]。

综上所述，随着近年来成像和基因编辑技术的快速发展，斑马鱼在多种疾病模型中发挥了重要作用，尤其是AKI多样的建模方法为研究人员提供了丰富的研究模型。从药物筛选、肾脏再生到基因组编辑，斑马鱼模型在破译发病机制的遗传和分子通路方面都做出了突出贡献。这些发现已被证明可用于治疗人类肾脏疾病，并可能在不久的将来大大促进肾脏疾病的治疗。