非小细胞肺癌细胞学样本分子病理学检测现状

徐海苗，童卫青

作者单位：310022杭州，中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）

肺癌样本的分子检测目前主要应用组织样本进行检测，是目前驱动基因检测的金标准。常用检测方法包括直接测序法、PCR、荧光原位杂交（FISH）及高通量二代测序（NGS）等。然而，细胞学样本作为非小细胞肺癌（NSCLC）病理学样本的重要组成部分，常是诊断肺癌类型和开展靶向基因检测的唯一标本来源，尤其对于中晚期肺癌和复发转移性肺癌等，细胞学样本来源丰富，对此类样本进行分子检测意义尤为重大。同时，细胞学标本多采用快速乙醇固定，组织新鲜，使其提取的DNA质量较高，分子检测成功率也较高。有研究表明，与组织学标本相比，细胞学标本分子检测有相似或甚至较高的敏感性和准确率。本文旨在回顾近年来肺癌细胞学样本分子检测的相关文献，阐述其检测现状及今后发展。

1 痰液

痰液脱落细胞检查一直作为肺癌，尤其是中心型肺癌诊断的重要方法，且在痰标本中可以进行HnRNP、KRAS等多个基因检查，对于是否能在痰液样本上进行EGFR突变检测也是临床诊断关注的焦点。Hubers等研究结果发现，在已确诊EGFR突变NSCLC患者的痰液标本中，EGFR在不同实验方法下的阳性表达率为30%～50%，而在慢性阻塞性肺疾病患者中无一例检出表达。这说明痰液具有作为基因突变检测标本的潜能，但其与组织表达位点的一致性尚未可知。王飞等收集了40例疑似肺癌患者的痰液，分别做痰细胞学检测和FISH检测，结果显示FISH和细胞学检查的敏感度分别为80.6%和22.6%，特异性分别为77.8%和100.0%，诊断符合率为80.0%和40.0%。这说明痰液样本在肺癌诊断中FISH较常规细胞学具有更高的敏感度和诊断符合率，FISH能明显改进肺癌的诊断，可以作为肺癌细胞学诊断的补充。

痰液中脱落细胞是肺组织损伤的直接表现，因痰液取材方便，无创，操作简单，相对经济，其正逐渐用于肺癌的辅助诊断，可作为对高危人群进行筛查和及早发现早期肺癌的一种常规检测方法，具有良好的应用前景。

2 浆膜腔积液

晚期NSCLC首诊患者10%～15%存在恶性胸腔积液，复治患者中恶性胸腔积液的比例更高，可达到50%以上。目前已有多项临床研究显示采用胸腔积液作为组织替代品进行检测有较高的可行性。Hung等结果结果表明，检测恶性胸腔积液细胞中EGFR突变是一种可行的辅助方法。王斯等选取了NSCLC患者的胸腔积液与配对肿瘤组织样本，将胸水制成细胞蜡块，脱蜡后提取DNA，采用ARMS方法检测样本中EGFR基因第18～21外显子突变情况，研究表明，在胸水组EGFR基因突变率为48.61%；活检组织组EGFR基因突变率为51.39%，两者差异无统计学意义，两者的一致率较高。Soh等收集了61例NSCLC患者的胸腔积液，采用直接测序、非富集PCR、突变富集PCR和肽核酸锁存核酸（PNA-LNA）PCR检测EGFR的突变状态。结果显示突变富集的PCR检测到16例突变病例，其中未富集PCR方法未能检测到3例突变；在富集突变PCR与PNA-LNA PCR钳夹检测的差异中，仅富集突变PCR检测到3例外显子19缺失，L858R突变无差异。直接测序法和非富集PCR法的结果无差异。而且研究显示EGFR突变组的总生存期和无进展生存期显著长于野生型，因此胸腔积液中EGFR突变状态可作为吉非替尼治疗的NSCLC患者良好预后的生物标志物。

3 针吸穿刺细胞学

3.1 支气管内超声引导针吸活检技术（EBUS-TBNA）EBUS-TBNA是近年来出现的一项新的微创诊断技术，在传统气管镜检查的基础上增加了多普勒超声的方法。Santis等应用超声内镜细针穿刺技术，检查收集13l例液基细胞标本，使用共扩增-PCR（COLD-PCR）和直接测序筛选EBUS-TBNA获得的细胞学样本中EGFR和KRAS突变的可行性，与标准PCR不同，在较低变性温度下的COLD-PCR优先扩增突变序列，从而提高了检测基因突变的敏感性，自首次报道以来，COLD-PCR已被证明在许多用于检测混合样本突变的应用中优于常规PCR，结果显示其中126例符合基因检测分析标本要求，结论是NSCLC通过EBUS-TBNA可以为大多数患者的EGFR和KRAS突变分析提供足够的肿瘤材料。

3.2 经皮肺结节穿刺细胞学检查 王海彦等收集228例不可手术切除的Ⅱ～Ⅳ期肺癌患者，进行CT引导下经皮肺穿刺活检，218例穿刺取材标本成功，提取DNA，采用实时荧光定量RCR技术直接测序法进行EGFR18～21外显子突变双向直接测序，共检测到93例基因突变，其中EGFR18、19、20、21外显子突变分别为2、52、3、36例。因此，CT引导下经皮细针穿刺活检可作为中晚期肺癌EGFR基因检测的取材手段。Scarpa等连续收集经皮细针穿刺肺腺癌细胞学标本38例，肿瘤细胞从细胞涂片中刮除，在显微镜下手工显微切割，以获得至少100个肿瘤细胞，提取DNA，采用二代测序（NGS）的方法对22个肺癌相关基因的504个突变热点同时进行评估，36例（95%）成功测序，分别在16%（6/36）和28%（10/36）的病例中发现EGFR和KRAS突变，而且两者是相互排斥的。

3.3 淋巴结穿刺细胞学检查 张智慧等收集了85例肺癌转移淋巴结针吸液基保存液标本，同时，19例有手术后的组织标本作为匹配，结果显示EGFR突变率为37.3%，KRAS突变率为7.2%，与组织学的一致性为100%。13例有EGFR突变的患者临床分期IV期，使用酪氨酸抑制剂治疗后，2例完全缓解（16.7%），8例部分缓解（66.7%），3例达到稳定（25.0%）。由此可知，细胞学针吸穿刺标本可作为基因检测标本来源之一，对后续靶向治疗有指导性意义。Qiu等收集89例肺腺癌患者的淋巴结转移灶细针针吸穿刺标本，应用NGS对其进行基因检测，研究发现EGFR基因突变率为34.0%，KRAS基因突变率为8.0%，BRAF基因突变率为3.0%，同时也检测到PIK3CA、TP53、APC、MET、GNAS和HRAS等基因的异常改变。因此，NGS适用于FNAC获得的肺腺癌转移淋巴结标本的基因突变筛选，并可能促进肺腺癌患者靶向新疗法的开发。

4 纤维支气管镜下刷检/肺泡灌洗液

纤维支气管镜刷片细胞病理学检查是当前诊断肺癌及肺部其他恶性肿瘤较好的方法，具有简便、快速及准确率高等特点，对于临床诊断和治疗，尤其对于早期发现肺癌的作用越来越大。

一项研究收集了50例疑似中央型肺癌患者，获取刷检细胞标本及钳活检组织，细胞标本制成细胞块，分别采用NGS方法检测，发现在62%的肿瘤阳性刷片样本中是可行的，在这些病例中，78%的NGS与组织学标本显示相同的结果，有22%来自刷检涂片的NGS检测到特定的突变，而来自钳活检的DNA质量不足以进行NGS分析。刷检涂片分析的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为66%、100%、100%和21%。

Kanaji等收集了161例纤维支气管镜刷检细胞学标本，从细胞中提取RNA，合成cDNA，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行基因异常的分析，发现EML4-ALK融合基因在NSCLC中的阳性率为3.1%（5/161），在肺腺癌中的阳性率为4.5%（4/88），EGFR在NSCLC中的突变率为24.2%（39/161），在肺腺癌中的突变率为40.9%（36/88）。

支气管肺泡灌洗液标本是在CT引导下通过支气管镜对特定的肺段、亚肺段灌洗后取得，可获得支气管镜所不能探及的细胞学标本，提高了肺癌诊断的阳性率，已广泛用于诊断肺部疾病，尤其是对一些不能行肺穿刺活检或开胸活检的肺疾病，其能直接取得肺病变的局部信息。但由于其临床应用较为局限，且标本中癌细胞含量较低，所以很少用于基因检测。

Asaka等从219例患者中收集新鲜的肺泡灌洗液标本，进行细胞学诊断，确诊为原发性肺腺癌77例，制成细胞蜡块并进行DNA提取，采用ARMS的方法进行分析，检测EGFR突变，并与49例手术切除或活检组织标本进行比较，成功分析了77例肺泡灌洗液标本的突变状态，结果与49例手术切除或活检组织标本的突变状态一致。另外研究表明甚至在10个含有足够肿瘤细胞的细胞学标本中检测到EGFR突变，因此，用肺泡灌洗液标本进行EGFR突变检测是一种有用和可靠的方法，特别是当没有获得足够的癌细胞时。

5 脑脊液

肺癌脑转移的发生率可达40%，而50%的脑转移瘤的原发灶在肺部，因此，脑转移已成为肺癌的主要死亡原因之一。临床需要一种替代的、更敏感的脑转移诊断方法。Yang等收集了30例肺腺癌脑转移患者，比较脑脊液样本和配对的原发性肺肿瘤组织样本之间的EGFR状态，抽吸脑脊液5 ml，采用纤维支气管针吸或经皮经胸活检获取相应的组织，分别从肺肿瘤组织和脑脊液标本中提取基因组DNA和无细胞DNA，使用ARMS-PCR检测。结果显示共有13例（43%）患者明确为EGFR突变，与组织标本比较，显示脑脊液作为EGFR基因检测的敏感性和特异性分别为67%和82%，可以作为颅内肿瘤患者临床EGFR-TKI治疗的指南，ARMS-PCR可能是检测肺腺癌脑转移患者脑脊液中EGFR突变的一种突变DNA丰度较低的敏感方法。

另一项研究收集了29例肺腺癌疑似癌性脑膜炎患者，行腰椎穿刺，抽吸10 ml脑脊液，采用经支气管肺活检或针吸法从原发癌中采集组织标本，分别提取DNA，采用PCR法分析脑脊液EGFR状态。结果显示有13例（45%）脑脊液中检测到EGFR突变。在16例脑脊液细胞学检查阴性的患者中，有5例（31%）检测到EGFR突变。在4例患者中，脑脊液中显示EGFR突变，但在原发灶或转移灶中没有。相反，在2例脑脊液细胞学呈阳性的患者中未检测到EGFR突变，而在原发灶或转移灶中检测到肿瘤细胞EGFR突变，这说明脑脊液中的EGFR突变并不总是反映原发灶或转移灶的相同状态。

综上所述，支气管刷检细胞学样本的基因突变检测对早期未见明显肿物及晚期无法获得组织样本的NSCLC患者具有很高的临床应用价值。作为肿瘤基因突变检测样本，样本中肿瘤细胞的纯度与检测准确率密切相关，但在脑脊液平台上支气管刷检细胞学标本作为替代活检组织标本的最低肿瘤细胞纯度，其要求还是未知的，需要进一步探索。

(参考文献略，读者需要可向编辑部索取)