外泌体在子痫前期血管内皮损伤中的作用

张 涛，孟金来,2*

(1.山东大学附属省立医院,济南 250021；2.山东第一医科大学附属省立医院,济南 250021)

子痫前期(pre-eclampsia，PE)严重威胁母婴健康,是孕产妇和围产儿死亡率升高的重要原因[1],约3%～5%的孕妇患有PE。PE是多病因、多机制、多阶段发展的复杂病理过程。随着研究深入,Redman[2]将发病机制从“二阶段学说”细化为“六阶段模式”，其中第四阶段即指进入妊娠后半期，各种胎盘源性的损伤因子释放进入母体血液循环，可引起血管内皮损伤和促进系统性炎性反应的激活。血管内皮细胞作为机体屏障，具有调节血管舒缩、物质交换及吞噬细菌等作用，而PE的高血压、靶器官受损的临床症状证明出现血管内皮功能障碍。本文对胎盘外泌体对PE发病中发生血管内皮损伤的机制进行综述，为疾病预测及治疗提供依据。

1 PE与外泌体

外泌体是由活细胞释放的纳米囊泡(50～100nm)，为脂质双层膜结构[3]。这些小泡可来自多种细胞[4]，广泛存在于体液中,包括血液、尿液、脊髓液、母乳和唾液等[5]。纳米囊泡是细胞膜和胞质蛋白、脂质、RNA以及负责细胞间遗传物质交换的载体，参与多种细胞外功能。正常妊娠中，胎盘细胞分泌的外泌体在妊娠6周就在母体循环中被发现，其浓度随着孕周的增长而增加[6]。滋养细胞分泌的携带胎盘特异蛋白和微小RNA的外泌体可介导胎盘与母体之间的细胞通讯，并产生相应的生物学效应[6]。有研究表明缺氧环境诱导外泌体分泌的增加[7]。目前可以分离并标记从胎盘细胞释放的外泌体[5]，并证明滋养细胞释放的外泌体具有生物活性，可调节细胞靶向的生物学功能。在病理妊娠时，如PE孕妇胎盘分泌的外泌体组份会发生改变，在PE的发病中产生作用。

早发型PE和晚发型PE外周血中外泌体总数均较正常妊娠增加，但Pillay等[8]发现两者间胎盘来源外泌体的相对浓度存在显著差异，早发型PE外泌体与总外泌体数之间呈正相关，而在晚发型PE中两者呈负相关，这可能与其病因学上的差异有关，表明胎盘来源的外泌体可能在PE病理变化中起作用。

2 外泌体在血管内皮损伤中的作用

一项对PE孕妇与正常孕妇胎盘血清微囊泡miRNA表达的研究发现，PE孕妇血清样本中22种miRNA表达差异显著，脐带血血清样本中8种miRNA表达差异显著。而胎盘样本中11种miRNA与PE表达相关[9]。3种来源的样本与PE表达相关的微小RNA具有一定相关性，如microRNA簇现象，多种miRNA与血管内皮调控相关[9]，且微囊泡中miRNA降解较少，含量稳定，来源单纯，较血清中游离的部分，灵敏度高，更适合作为疾病的诊断标记物。

2.1 诱导血管内皮细胞凋亡 内皮细胞内和周围环境中活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的生成在内皮细胞活化和功能障碍中起着重要作用。有研究证实，脓毒症中血小板来源的外泌体可从血浆中检测到，血小板源外泌体具有NADPH氧化酶和一氧化氮合酶[10]，这些微颗粒与血管内皮细胞一起孵育可通过NADPH氧化酶依赖通路在体外诱导细胞凋亡。另有研究发现，miR-221/222在ox-LDL诱导的人脐带静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells,HUVECs)凋亡中表达明显下调。miR-221/222抑制可增强内皮细胞凋亡，而miR-221/222过表达可通过抑制Ets-1及其下游靶蛋白p21，部分减轻ox-LDL介导的凋亡性细胞死亡[11]。

2.2 在氧化应激及炎症反应中的作用 研究表明，来自不同组织的外泌体能诱导靶细胞中ROS的生成，如间充质干细胞分泌的外泌体减少了ROS的生成[12]。ROS可引起全身炎性反应,诱导滋养层细胞的凋亡从而影响滋养层细胞的浸润能力,还可引起内皮源性舒张因子NO的失活,使血管舒张不良、内皮功能障碍,在妊娠期高血压疾病发病中起作用。

Hadley[13]用羊膜上皮细胞外泌体处理子宫肌层及蜕膜细胞，发现IL-6、IL-8和PGE2的分泌增加,通过激活NF-κB调节肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和其他炎症因子的转录，导致母体子宫细胞炎症反应增加,IL-6水平升高可刺激血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(angiotensinⅡtype 1 receptor-activating antibody,AT1-AA)的产生，AT1-AA还刺激组织因子和NADP氧化酶的产生，在血管损伤和氧化应激中发挥作用。此外，miR-155和miR-221/222通过靶向血管紧张素II(angiotensinⅡ,AngII)刺激HUVECs中的AT1R或转录因子Ets-1参与内皮细胞炎症和迁移[11,14]。

绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast,EVT)释放的胞外小泡(small extracellular vesicles,SEV)在妊娠早期调节子宫螺旋动脉重构。有研究在1%O2(缺氧)和8%O2(常氧)培养的HTR-8/SVneo细胞分离的SEV中鉴定到507个差异丰富的蛋白质，它们主要与炎症相关的途径有关[15]。研究中体外低氧SEV与内皮细胞孵育后，GM-CSF、IL-6、IL-8和VEGF的释放明显升高；孕鼠体内注射低氧SEV后，平均动脉压明显升高，收缩压和舒张压均升高。证明氧分压调节EVT中SEV的释放和生物活性，并且这些SEV调节炎症和母体血压，缺氧胎盘释放的胎盘细胞来源的SEV可能参与了子痫前期的生理病理过程。

2.3 对血管舒张功能的作用 外泌体内包含多种miRNA，一些miRNA参与了肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin-System，RAS)功能和AT1-AA的产生，PE患者胎盘miRNA-155表达上调[16]，抑制miR-155可增加AT1-R表达，增强AngII诱导的磷酸化erk1/2的活化。此外，与正常胎盘相比，PE胎盘中miRNA-21表达明显上调，miRNA-21通过调节一氧化氮合酶的表达，干扰内皮依赖的血管舒张功能等[4]。此外，内皮素(endothelin，ET)是一种内源性长效血管收缩调节因子，是由内皮细胞受刺激合成分泌，ET-1是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质。PE孕妇因胎盘缺血缺氧，ET-1含量明显升高，血管舒缩功能紊乱是导致PE发病的关键之一。

3 外泌体与血管生成

血管生成需要血管内皮细胞的管腔结构的建立和重塑,外泌体携带多种细胞因子、miRNAs参与血管生成的调节，在PE患者血管生成中扮演重要的角色。

3.1 在促血管生成中的作用 在母体水平，VEGF通过刺激NO和前列环素的产生，维持肾、肝和脑中有孔内皮细胞的健康，稳定内皮细胞。最近一项研究发现，正常妊娠与PE患者外泌体miRNA表达存在明显差异，其中血清样本中，参与调控VEGF表达的有miRNA-320c、miRNA-517b、miRNA-521等[9]。研究发现，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)外泌体在体内和体外都具有促血管生成作用[17]，研究中对MSC外泌体蛋白组分析发现血管生成相关通路的高表达:钙黏蛋白、EGFR、FGF和PDGF，及MSC外泌体通过NF-κB途径在内皮细胞中诱导血管生成。

最近研究发现，细长聚球藻[18]主要通过功能性EV的递送，IL-6表达增加可能是其诱导的促血管生成和伤口愈合作用的机制。从动脉粥样硬化患者外周血中分离的外泌体于大鼠后肢缺血模型局部注射可使缺血部位新生血管的增加[19]。体外和体内实验[20]表明，来自循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的外泌体将与PI3K/Akt信号通路和miR-126和miR-296等促血管生成相关的miRNA转移到受体ECs中，激活PI3K/Akt信号通路，促进血管生成。

碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)是由低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF1)在低氧条件下诱导的，在包括肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)在内的多种肿瘤中均有过表达。最近研究发现，超离心分离的肾癌细胞外泌体中检测到大量CA9[21]，CA9通过促进HUVEC的迁移和成管促进血管生成，且检测到MMP-2水平升高，而MMP-9水平没有升高，这对细胞迁移和侵袭都至关重要，表明MMP-2可能至少参与了CA9外泌体促进血管生成的作用[21]。

3.2 在抗血管生成中的作用 抗血管生成因子包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)、可溶性内皮素(soluble endoglin,sEng)、纤溶酶原激活物抑制剂1、生长因子抑制剂、炎性细胞因子、ROS或超氧阴离子、缺氧诱导因子和AngⅡ抗体受体。目前研究发现，sFlt-1与早发型PE关系较为紧密，sFlt-1是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)受体的可溶形式；sFlt-1不直接参与血管生成，是血管生成的负调节剂[22]。有研究发现，PE的外泌体表达了大量的sFlt-1和sEng，且介导sFlt-1和sEng向内皮细胞的转移,损害PE患者的血管功能并诱发并发症。研究中分离收集了高水平sFlt-1和sEng的外泌体，并在人胚胎肾293细胞中过表达，且在体外证明这些外泌体能减弱HUVEC的增殖、迁移和管形成能力[7]。在小鼠模型中，PE患者的外泌体引起的血管功能障碍直接导致不良的子痫前期样分娩结局。

有研究表明，与正常妊娠相比，PE患者体内外泌体miRNA-16表达水平增高[17]，miRNA-16传递至内皮细胞后靶向内皮细胞下调VEGF表达，抑制内皮细胞的增殖和迁移,抑制血管生成[23]。研究发现,脐带血来源的外体miR-125a-5p在PE胎盘组织中的表达高于正常对照组，而VEGFA在PE胎盘组织中的表达低于正常对照组，将miR-125a-5p模拟物组与阴性对照组进行比较，发现模拟物组细胞迁移、增殖和血管生成能力降低[24]，更多的细胞阻滞在S期，证实miR-125a-5p的表达异常可能通过调节VEGFA影响HTR8/SVneo细胞的增殖和迁移，抑制血管生成，参与了PE的发生发展。

4 展 望

PE的临床发病机制尚未完全明确，血管内皮损伤可能参与其发生及发展。在PE早期，胎盘产生的外泌体数量、内容物及活性发生了改变，在PE血管内皮损伤的发病机制中起重要作用。目前如何对各种细胞来源的外泌体分离鉴定，并明确其靶细胞与功能，仍需进一步探索。进一步深入探索胎盘组织分泌的外泌体的生物学机制，有助于为早期诊断和治疗PE提供新思路。