巨噬细胞ABCG1介导的氧化固醇外流的研究

刘平原 沈思琪 武燕翔 陈连凤 严晓伟

100730 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院心内科

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)以内皮下脂质蓄积、粥样斑块形成及动脉管腔狭窄为特征，可引起冠心病、脑梗死、外周血管病等一系列疾病，是世界范围内最常见的疾病和死亡原因[1]。ABCG1是跨膜半转运体，在巨噬细胞中高表达并介导胆固醇外流，对体内脂质代谢稳态有重要作用。本课题组前期临床研究提示人类巨噬细胞ABCG1的表达可能具有促AS作用[2]，其机制尚待进一步研究。近来研究发现氧化固醇，如7β-羟基胆固醇(7β-hydroxycholesterol，7β-OHC)和7-酮基胆固醇(7-ketochlesterol，7-KC)等[3]，与AS的发生发展关系密切[4]。本实验通过构建ABCG1敲低单克隆稳转株，测定其氧化固醇外流情况，以探究ABCG1影响AS发生发展的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞(ATCC细胞库)，RPMI1640培养基、FBS(GIBCO公司)，引物(上海生物工程公司)，慢病毒表达载体、DH5α、转染试剂LipofectAMINE2000、NBD-胆固醇(Invitrogen公司)，DNA连接酶、限制性内切酶、反转录酶(Fermentas公司)，质粒抽提试剂盒(Qiagen公司)，兔抗人ABCG1抗体(Abcam公司)，兔抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶偶联IgG(中杉金桥生物公司)，PMA、HDL(Sigma公司)，ox-LDL(北京协生生物公司)，质粒测序由Invitrogen公司完成。

1.2 稳转株构建

根据ABCG1基因序列设计shRNA oligo，将其连接到pGMLV-SC5RNAi载体构建慢病毒重组质粒，选取测序正确的质粒进行病毒包装；按照MOI=80利用慢病毒感染THP-1细胞，经有限稀释法筛选出稳定敲低细胞株；提取稳转株细胞总蛋白，并进行Western blot鉴定ABCG1表达。ABCG1 shRNA上游序列5’-gatccGGACCTGCTGAATGGACATCTT TCAAGAGAAGATGTCCATTCAGCAGGTCCTTTTTTg-3’，下游序列5’-aattcAAAAAAGGACCTGCTGAA TGGACATCTTCTCTTGAAAGATGTCCATTCAGCAGG TCCg-3’。阴性对照上游序列5’-gatccGTTCT CCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTT CGGAG-3’，下游序列5’-aattcACGCGTAAAAAA GTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGAC ACGTTCGGAGAACg-3’。

1.3 巨噬细胞氧化固醇外流测定

1.3.1 细胞处理及样本收集 THP-1细胞以3×105/孔的密度接种于24孔板，以100 ng/ml PMA促进巨噬化。72 h后更换培养基，以无血清培养基饥饿8 h，以50 μg/ml 氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)干预。24 h后，PBS洗涤细胞三次，加入50 μg/ml 高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)作为外流接受体诱导外流4 h，并设置空白对照组。收集外流液，12 000 rpm离心10 min，去除细胞碎片。PBS洗涤细胞三次，每孔加入10%甲醇水溶液+1%乙酸处理细胞5 min，收集裂解液。向外流液与细胞裂解液中加入3倍体积沉淀剂沉淀蛋白，10 000 rpm离心10 min，取5 μl进行脂质分析。

1.3.2 样本分析 通过LC-MS/MS(DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪 Thermo Q EXACTIVE)进行样本分析。将收集到的样本经ACQUITY BEH C18色谱柱分离 (1.7 μm，2.1×50 mm)。随后进行一个从70%水-30%乙腈到100%乙腈的8 min梯度洗脱，设定流速为0.25 ml/min。采用电喷雾正离子源，以二级数据依赖性扫描的检测模式，对样本进行定性与定量分析。7β-OHC和7-KC标准品绘制标准曲线用于样本定量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ABCG1基因小干扰RNA慢病毒表达载体构建及稳转株ABCG1蛋白表达情况

转染后，细胞内可观察到明显的荧光，表明目的质粒转染正常，目的质粒荧光标记基因表达正常(图1)；ABCG1敲低组(ABCG1-sh)ABCG1蛋白表达水平(0.173 5±0.034 35，n=3)明显低于阴性对照组(0.755 6±0.044 54，n=3)，差异有统计学意义(P<0.001)，见图2，提示ABCG1稳定敲低细胞株构建成功。

图1 转染后细胞荧光观察

图2 各组细胞ABCG1蛋白水平

2.2 ABCG1低表达对氧化固醇外流率的影响

通过LC-MS/MS技术对待测样品进行了氧化固醇定性与定量分析，发现与无外流接受体的空白对照组相比，HDL作为外流接受体的组别，诱导氧化型胆固醇外流率增加(7-KC：28.6%±2.3%比4.1%±0.7%，P<0.001；7β-OHC：35.5%±5.7%比3.7%±1.1%，P<0.001)，见图3A。与阴性对照组相比，ABCG1敲低组氧化型胆固醇的外流率降低(7-KC：16.1%±3.1%比24.7%±2.3%，P<0.05；7β-OHC：15.7%±0.7%比33.1%±3.7%，P<0.001)，见图3B。

图3 巨噬细胞氧化固醇外流率

2.3 ABCG1低表达对巨噬细胞胞内氧化固醇沉积的影响

胞内氧化固醇沉积量通过细胞总蛋白进行校正，结果显示，与对照组比较，ABCG1低表达巨噬细胞胞内氧化固醇沉积增加[7-KC：(6.61±1.28)μg/mg比(2.13±0.08)μg/mg，P<0.05；7β-OHC：(1.61±0.51)μg/mg比(0.65±0.20)μg/mg，P<0.05]，见图4。结合图3结果表明巨噬细胞ABCG1低表达可抑制氧化固醇7β-OHC及7-KC外流，增加胞内氧化固醇沉积。

图4 巨噬细胞胞内氧化固醇沉积

3 讨论

巨噬细胞摄取ox-LDL形成泡沫细胞是AS的早期病理标志[1]。构建ABCG1敲低巨噬细胞模型可为ABCG1及AS的研究创造条件。本课题组前期通过嘌呤霉素筛选法构建了ABCG1敲低混合稳转株，其是由多个单克隆稳转株构成的克隆群。因其外源片段的整合位点不同，不同的单克隆表达效率不同[5]。此外，由于体外细胞多属于病胞系，其基因组呈现不确定的特点，即使是同类细胞，不同细胞个体基因组背景都存在差异。因此，本研究对前期ABCG1敲低细胞模型的构建进行改进，通过有限稀释法获得了ABCG1敲低单克隆稳转株，其为含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增，ABCG1的表达效率稳定，且基因组背景相对单一，可去除细胞群体的干扰因素，进一步减少实验结果的干扰因素。

本课题组前期研究结果发现，ABCG1低表达巨噬细胞促凋亡基因Bok与Bid表达增高[6]，细胞凋亡加快。结合本实验结果，其可能与ABCG1介导的氧化固醇外流密切相关。本研究中，我们发现ABCG1低表达的巨噬细胞7-KC及7β-OHC外流减少，胞内氧化固醇沉积增加。氧化固醇由胆固醇通过酶催化氧化途径及非酶催化氧化途径形成，在单核细胞/巨噬细胞中沉积可诱导细胞凋亡[7]。Tesoriere等[8-10]发现，当7-KC及7β-OHC与巨噬细胞共孵育时，细胞氧化性DNA损伤增加，p21、Bax及细胞色素C表达水平增强，线粒体凋亡途径激活，细胞凋亡增加。

巨噬细胞ABCG1在胆固醇逆转运中发挥重要作用，而其对AS的作用，在多项动物及临床研究中结果并不一致，目前仍存在争议[11]。Tarling等[12]发现ABCG1基因敲除小鼠AS病变区域巨噬细胞凋亡增加，粥样斑块体积缩小。以上研究及本实验结果提示我们，巨噬细胞ABCG1低表达造成胞内氧化固醇堆积，加速细胞凋亡，可能是ABCG1低表达抗AS的相关机制。

利益冲突：无