液相色谱串联质谱技术在载脂蛋白E室间质量评价中的应用

李卿，居漪，虞啸炫，孙贺伟，虞科颖

(上海市临床检验中心参考测量实验室，上海200126)

载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)作为脂质转运蛋白和低密度脂蛋白受体的主要配体，在胆固醇代谢和心血管疾病中发挥重要作用[1-2]。APOEε4等位基因是阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的主要危险因素[3-5]。血清apoE增高与心血管疾病死亡率增加有关，而降低则与AD相关死亡率增加有关[3,6-7]。这些研究发现是基于免疫法，大多数是常规检测中的免疫透射比浊法(immunoturbidimetry assay，ITA)。然而，基于免疫法的apoE的研究数据差异较大[8-10]，而基于液相色谱串联质谱法(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS/MS)的研究数据一致程度较高[11-14]。LC-MS/MS在定义被分析物和抗干扰方面具有优势，且在血清载脂蛋白的绝对定量上已有较为成熟的应用[15]，但未见其用于apoE室间质量评价(质评)中的报道。本研究首次使用已建立的血清apoE LC-MS/MS定量方法[16]，为室间质评样品赋值，探讨其在室间质评中的应用潜力。

1 材料和方法

1.1血清样品 本中心2019年度EQA样品，混合人血清，编号分别为sA、sB、sC、sD和sE。EQA样品由冷链物流运输，参加者使用日常检测系统检测1次。校准品为人血清制品，apoE含量为12.8～54 mg/L，由荷兰莱顿大学医学中心惠赠。

1.2主要仪器与试剂 分析系统包括Agilent 1290 Infinity超高效液相系统(美国Agilent公司)和AB5500 QTRAP三重串联四级杆质谱仪(美国AB Sciex公司)。使用正离子模式和多反应监测(MRM)方法。Zorbax eclipse SB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美国Agilent公司)。

二硫键还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)购自美国Thermo Fisher公司，碘乙酰胺(IAA)、脱氧胆酸钠(DOC)、Tris缓冲液购自美国Sigma-Aldrich公司。甲醇、甲酸为LC-MS级，分别购自法国Biosolve公司和美国Sigma-Aldrich公司。胰蛋白酶为测序级，购自美国Promega公司。实验用水为Millipore超纯水机所制(电阻率18.2 MΩ)。同位素标记多肽由国平药业公司合成，纯度>98%，标记位点为精氨酸的C和N。

1.3方法

1.3.1定量和定性肽段的选择 根据本实验室前期研究结果[16]，使用序列为SELEEQLTPVAEETR肽段作为定量肽段，LGPLVEQGR肽段为定性肽段，具体信息见表1。

表1 所用肽段信息及部分质谱参数

1.3.2胰蛋白酶酶解及质谱分析 样品20倍稀释后，依次加入0.523% DOC、2.3 mmol/L TCEP和14.3%同位素标记多肽于100 mmol/L Tris溶液中，56 ℃变性30 min。冷却后，每支样品加入4.6 mmol/L IAA 20 μL，室温避光放置30 min。加入胰蛋白酶24 μL，37 ℃酶解；加入终止液(4.7%甲醇和0.6%甲酸的水溶液)终止。LC-MS/MS的LC部分：流动相A为5%甲醇和0.05%甲酸水溶液，流动相B为95%甲醇和0.05%甲酸水溶液；流速为0.2 mL/min；进样5 μL。洗脱梯度：流动相B，0.0～6.0 min 15%～85%；6.0～8.0 min 85%；8.0～8.1 min 85%～100%；8.1～10.0 min 100%；10.1～15.0 min 100%～15%。LC-MS/MS的MS部分：离子对的选择见表1。每个样品检测2次，取均值。

1.4统计学分析 采用统计软件JMP 13.0绘制不同方法分组所对应的相对偏倚图。相对偏倚=(参加者结果-LC-MS结果)/LC-MS结果×100%。对EQA结果计算不同方法组的均值和CV。

2 结果

2.1EQA结果 见表2。76家实验室用ITA检测sA、sB、sC、sD、sE样品apoE结果分别为：15.7～20.8 mg/L、41.7～47.6 mg/L、63.9～69.7 mg/L、83.1～94.4 mg/L和112.9～129.7 mg/L。

表2 EQA结果

2.2不精密度和相对偏倚 sB～sE样品，除瑞源外(CV>10%)，其他方法组内的不精密度为1.7%～8.8%。sB～sE样品的总CV在8%左右。sA样品的组内不精密度大于其他样品，总CV为14.5%。积水的相对偏倚绝对值的均值最小，为8.7%，而蓝怡最大14.6%，见表2。每种ITA的偏倚和CV均不相同，见图1。高浓度样品(sD和sE)比低浓度样品(sA、sB和sC)更接近LC-MS/MS结果。

2.3EQA结果评价 以靶值±15%为判断标准，不同品牌的合格率见表3。除积水外，其他品牌检测sA样品的合格率均为0.0%。随着EQA样品浓度的增高，多个品牌的合格率有逐步增高趋势。

表3 不同品牌EQA结果评价合格率(%)

3 讨论

本实验室前期研究发现，LC-MS/MS法与免疫法具有较好的相关性(r=0.97)；LC-MS/MS法的不精密度为5.2%，与靶值的相对偏差为3.6%～7.6%[16]。本研究发现，除sA样品外，sB～sE的ITA结果比LC-MS/MS结果低约6%；可能是apoE的基因型及两种方法的特异性不同而造成。血清apoE含量在3种等位基因型之间(ε2,ε3和ε4)，区别较大。基因型变化从ε22、ε32、ε42、ε33、ε43至ε44，apoE含量逐渐降低，可降低约65%(即55 mg/L)。

简单地说，绝对定量方法使用合成的同位素标记肽作为内标物，检测样品中天然肽的浓度。本研究使用了SELEEQLTPVAEETR作为定量肽段。实验表明，3 h的酶解可实现该肽段的完全释放。更重要的是，该肽段位于apoE2、apoE3和apoE4的共同区域，定量结果就是总apoE的水平。因此，相对于质谱法明确清晰的分析目标而言，免疫法可能会低估总apoE的含量。

血清apoE降低10 mg/L带来的AD相关死亡率的风险比为1.7[6]。对于样品sA、sB、sC、sD和sE，反馈结果相对于LC-MS结果降低10 mg/L以上的分别占27.6%、5.3%、28.9%、17.1%和21.1%，表明使用这些实验室出具的报告，患者可能被错误分类为AD相关死亡风险增加。

当血清apoE在45 mg/L以上时，全因死亡率随着apoE含量的增加而上升。sB样品apoE为49 mg/L，接近于45 mg/L，以靶值±15%为判断标准(参照美国CAP的载脂蛋白A和B的正确度验证计划的判断标准)，86.8%的实验室在此范围内。

本研究使用的EQA样品为混合人血清样品，可能包括不同的ε2/ε3/ε4基因型，不能显示ITA的特异性，对于结果在ITA和LC-MS之间的偏倚无法深入分析，采用单一来源人血清样品可能会提供更多有价值的信息。