联合运用Triton X-100和多聚甲醛改善血液肿瘤骨髓标本荧光原位杂交检测质量*

傅蔷，谢珊珍，叶常姜，黄慧芳

(1.福建医科大学附属协和医院a.福建省血液病研究所，福建省血液病学重点实验室，b.中心实验室，福州350001；2.北京金菩嘉医疗科技有限公司，北京100176)

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术能够在荧光显微镜下直接观察探针信号，分析DNA序列变化，安全、快速、特异性好、灵敏度较高，被广泛应用于血液病的诊断分型、鉴别诊断、预后判断及移植后监测等方面[1]。

有效、清晰的荧光信号是保障FISH检测质量的关键。但在抽吸骨髓液标本的过程中，尤其是白血病与多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者的骨髓液，容易发生不同程度的凝固，导致背景荧光信号杂乱、非特异性荧光信号较强、探针信号微弱或缺失等现象。此外，骨髓标本中过多的纤维丝和细胞间的强粘附性等因素，也可能导致FISH探针信号进入细胞困难，造成FISH检测失败。

Triton X-100是一种表面活性剂，可以增强膜表面通透性。多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)是一种广泛用于免疫组化的固定剂，能保持组织的抗原性和细微结构[2]。本研究尝试在常规FISH实验流程中增加联用Triton X-100和PFA处理标本玻片步骤，以期获得更加清晰、有效的探针信号，改善间期FISH检测探针信号质量，提高FISH检测成功率及阳性信号检出率。

1 材料与方法

1.1临床资料 收集2018年在福建医科大学附属协和医院血液科就诊的42例血液肿瘤患者的骨髓标本，其中MM 25例，慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)8例，骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)6例，急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)2例，急性原始粒细胞白血病部分分化型(acute myeloid leukemia-M2，AML-M2)1例，诊断标准参照《血液学诊断及疗效标准》第4版[3]。其中男29名，女13名，年龄9～88岁，中位年龄55.5岁。建立各探针检测阈值共采用10例健康供者的骨髓标本，男7例，女3例，年龄22～45岁，中位年龄34.5岁。以上所有取样均获得患者知情同意，并通过福建医科大学附属协和医院伦理委员会批准(批准文号：2016KY050)。

1.2FISH检测 所用探针均购自北京金菩嘉公司。取-20 ℃保存的固定后的骨髓单个核细胞悬液，用新鲜固定液(甲醇与冰醋酸按体积比3∶1混合)调至合适浓度滴片，按照试剂盒提供的FISH操作说明书操作，Olympus BX51荧光显微镜在4，6-二脒基-苯基吲哚(DAPI)/异硫氰酸荧光素(FITC)/罗丹明(RHOD)三色滤光镜下观察杂交信号。

1.3Triton X-100/4% PFA预处理对FISH检测的改良作用 取-20 ℃保存的固定后的骨髓单个核细胞悬液，用新鲜固定液(甲醇与冰醋酸按体积比3∶1混合)调至合适浓度滴片，用Triton 100-X/4% PFA(4% PFA与0.5%Triton X-100按体积比1∶1混合)预处理1 min，吸干液体后置37 ℃预温的2×柠檬酸钠盐(SSC)溶液中温浴10 min。后续实验步骤同1.2。

1.4MM骨髓标本荧光免疫表型结合间期原位杂交技术(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms, FICTION)检测 肝素钠抗凝骨髓液充分裂解红细胞后，用-20 ℃预冷甲醇预固定，调至合适浓度滴片，Triton X-100/4% PFA固定标本玻片10 min，后续实验步骤同1.2。翌日杂交结束后，先后用小鼠抗人CD138抗体(一抗)和AMCA标记的山羊抗小鼠IgH抗体(二抗)(以上抗体均购自美国Pepro Tech公司)室温避光温育1 h。充分洗涤后加DAPI复染，Olympus BX51荧光显微镜在AQUA/FITC/RHOD三色滤光镜下观察信号。每份标本分析100个胞浆染为蓝色的浆细胞，不计数重叠细胞。结果判读和阈值建立同1.2。

1.5统计学分析 用SPSS 25.0软件进行。计量资料的组间比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Triton X-100/4% PFA预处理后的FISH探针信号更清晰 对照组FISH检测杂交区域非特异性信号杂乱，背景荧光强，探针内信号较小，易受背景及非特异性荧光信号干扰，结果判读困难。经Triton X-100/4% PFA处理后，杂交区域非特异性荧光信号减少，背景干净，细胞核内探针信号更清晰，以FITC标记的绿色荧光信号改善效果显著，见图1。

注：A，对照组，背景荧光杂乱，探针信号小；B，实验组，背景干净，探针信号清晰。

2.2Triton X-100/4% PFA预处理标本玻片能够提高FISH检测成功率 42例标本中共检测148个探针位点，对照组有11个位点因杂交信号细弱、非特异性荧光信号杂乱干扰无法分析，有的甚至细胞核内无杂交信号，导致FISH检测失败，检测失败率为7.43%(11/148)；Triton X-100/4% PFA预处理的实验组，FISH检测成功率达100%(148/148)。

剔除杂交失败的11个位点后，对有杂交信号的137个检测位点，分别分析200个细胞核中的信号，实验组中未见杂交信号的细胞比例为(4.30±3.30)%，对照组为(8.04±5.45)%，二者配对差值(实验组-对照组)为(-3.74±4.27)%，实验组未见杂交信号的细胞比例低于对照组(P<0.001)。

2.3Triton X-100/4% PFA预处理标本玻片使FISH检测结果更准确 在137个检测位点中，实验组与对照组的判读结果一致的有132个位点，其中实验组的阳性细胞比例为(82.16±23.89)%，对照组为(77.10±23.56)%，二者配对差值(实验组-对照组)为(5.06±10.08)%，实验组阳性细胞比例高于对照组(P<0.001)。

此外，有5个检测位点，实验组与对照组的判读结果不一致，见表1。除3号标本来自MDS患者外，其余均来自MM患者。为明确哪组结果更接近真实情况，4份MM标本均采用FICTION进行验证，FICTION检测的判读结果均与实验组一致，图2展示了25号标本的FICTION检测信号。3号标本经扩大计数范围至500个细胞后，对照组阳性细胞比例为3.0%，最终判定为阴性，与实验组一致。

表1 实验组与对照组判读结果不一致的5个检测位点

注：箭头所指均为浆细胞，探针为GLP IgH(断裂重组探针)

3 讨论

作为常规染色体核型检查的重要补充，间期FISH检测在血液肿瘤诊疗中应用广泛。FISH检测时，由于在激发光照射下，标本背景成分中的核蛋白、胞质蛋白、胶原纤维等均可产生荧光，容易形成非特异性背景荧光[4]。背景荧光强，判读信号荧光易受干扰；背景荧光弱，则信号荧光清晰，易于准确判读。因此，FISH检测时，除了要保证杂交成功，还应注意减弱背景荧光，增强信号荧光，即提高信噪比。

血液肿瘤细胞中往往含有较多的胞核蛋白和/或胞浆蛋白，干扰了探针与基因组DNA结合，致使探针信号不稳定[5]，最终可能造成间期FISH检测失败。另外，我们在临床工作中也发现，某些标本出现细胞核轮廓不清晰或空洞、背景荧光信号杂乱、非特异性荧光信号强以及探针信号拉丝现象严重、信号细弱甚至缺如等现象，导致人工阅片过程费时费力，判读结果误差大，遇到复杂信号模式时，极易受到非特异荧光信号的干扰而造成误判。这种情况与石蜡组织标本FISH检测中蛋白酶消化不完全时表现相似。

骨髓标本间期FISH常规操作流程中，没有消化步骤[6]，且骨髓标本与石蜡组织标本不同，蛋白酶消化时间难以掌握。因此，我们尝试联合非离子化学表面活性剂Triton X-100和交联固定剂PFA进行杂交前预处理。Triton X-100对疏水分子具有很高的结合亲和力，能够溶解磷脂膜，从而允许探针进入细胞核[7-8]。PFA是核酸最有效的固定剂，且没有自发荧光[9]。PFA在固定细胞膜和细胞内蛋白的同时，能够在一定程度上提高细胞膜的通透性，并可能与Triton X-100呈现协同作用[10]。有报道称，运用Triton X-100和4% PFA作为固定/渗透化合物能够增强肽核酸-荧光原位杂交的荧光信号强度[8]。

本研究发现，与常规流程FISH检测相比，经Triton X-100/4% PFA处理后，荧光显微镜下标本的非特异性荧光干扰显著减少，探针信号拉丝现象减少，信号点更清晰，尤以FITC标记的绿色信号效果显著。同时，经Triton X-100/4% PFA处理的标本，预处理时间从原来的30 min缩短至10 min，且未见到杂交信号的细胞比例明显降低，阳性细胞比例也显著提高。这不仅有效地缩短了实验操作时间，提高工作效率，而且使FISH检测成功率提高至100%，有效地降低了判读复杂、异常时的个人主观差异，使实验结果更加客观可靠。对实验组与对照组判定结果不一致的4例MM标本，我们进一步采用FICTION检测方法进行验证，发现4例标本的判读结果均与实验组一致。1例实验组与对照组结果不一致的MDS标本，经扩大计数范围至500个细胞后，最终判为阴性，该结果与实验组一致。

综上所述，通过在杂交前对标本玻片进行Triton X-100/4% PFA预处理，能够提高骨髓标本间期FISH检测成功率和阳性位点检出率。因此，在骨髓标本FISH检测时，检验人员可以根据疾病种类、标本状态和具体实验条件，酌情增加Triton X-100/4% PFA处理步骤，以期获得更加清晰的探针荧光信号。