从ADAM33基因T2位点多态性分析小儿支气管哮喘易感性及其严重程度的关系

李晓, 张磊，汤昱，许春娜

支气管哮喘是一种由多种细胞组分、细胞参与的呼吸科疾病[1]，常发于儿童群体，患儿多有胸闷、流涕、阵发性咳喘等症状，治疗不当会引发烦躁恐惧、大汗淋漓等症状，反复发作下会对其生长发育、身心健康不利。有研究表示该病的遗传易感性较为明显[2]，常会出现家族式聚集。随着克隆技术、基因技术的进步，目前已发现人体内整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)具有遗传易感性。为找出支气管哮喘与ADAM33 T2位点多态性有无相关性，以为后续研究提供资料，本文讨论如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2017年1月至2019年3月本院收诊的支气管哮喘患儿47例为观察组，其中男26例，女21例；年龄4～13岁，平均(7.45±0.62)岁；重度哮喘15例，中度17例，轻度15例。同期选取健康体检儿童47例为对照组，其中男25例，女22例；年龄3～13岁，平均(7.51±0.59)岁。两组研究对象在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照《支气管哮喘基层诊疗指南(2018年)》[3]中有关于支气管哮喘的诊断标准。哮喘严重程度：(1)轻度：1周有≥2 d(非每天)出现日间症状，且活动轻微受限；(2)中度：1周每天均会出现日间症状(非持续)，且活动部分受限；(3)重度：1周每天会持续出现日间症状，且活动严重受限[4]。

1.3 纳入标准 (1)符合支气管哮喘的诊断标准；(2)年龄3～13岁；(3)患儿家长已完成知情同意书的签署流程，并经本院伦理委员会审核通过。

1.4 排除标准 (1)并发肺间质性疾病、肺结核、心源性哮喘者；(2)临床病历资料未完全获取者；(3)存在肺部肿块者。

1.5 脱落与剔除标准 (1)检测期间出现严重不良事件者；(2)患儿家长主动撤回知情同意书。

1.6 方法 基因组提取：针对所有受试患儿，抽取肘静脉血3 mL，行乙二胺四乙酸抗凝、冷藏保存操作。通过细胞裂解液对样本进行裂解，离心沉淀完成需以蛋白酶K实施两次溶解。若溶液仍相对浑浊，表示其裂解程度一般，需再次实施有效裂解。酒精洗脱后进行离心处理，再对患儿的DNA浓度、纯度作相应检查，最后做好冷藏保存工作。基因组提取后，通过Labcycler型PCR仪(德国Sensoquest)进行有效PCR反应，再行限制性片段长度多态性分析(聚合酶链式反应)，主要以限制性内切酶NaR1实施。整体酶切体系中，20 μL总体系包括10×Buffer液2 μL、去离子水7 μL、限制性内切酶1 μL以及PCR产物(成功扩增)10 μL，于温箱(37 ℃)中进行酶切过夜处理，电泳时间维持为30 min，再通过凝胶成像仪行相应保存。已扩增的PCR产物测序完成后，通过BLAST软件(NCBI)对测序结果进行同源性分析，对其测序结果正确性进行验证。

1.7 观察指标 评测分析两组平衡定律(Hardy-Weinberg)、T2位点等位基因频率，观察其支气管哮喘严重程度与T2位点多态性有无相关性。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，计数资料采用χ2检验；单变量Logistic回归用于支气管哮喘与T2基因位点多态性的相关性分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组平衡定律检验详情的调查 T2位点基因频率上，两组研究对象均有较好的群体代表性，均满足平衡定律(Hardy-Weinberg)。见表1。

表1 两组平衡定律检验详情对比

2.2 两组基因频率分布详情的调查 T2位点等位基因中，观察组A的基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中罹患支气管哮喘的高危因素是A等位基因增加。见表2。

表2 两组基因频率的分布详情对比[n(%)]

2.3 哮喘患儿严重程度与其T2位点多态性的调查 T2位点等位基因中，重度哮喘患儿AG基因型频率与中度哮喘患儿比较，差异无统计学意义(P>0.05)；重度和中度哮喘患儿AG基因型频率均高于轻度哮喘患儿，差异有统计学意义(P<0.05)，提示支气管哮喘是否严重的高危因素是AG等位基因增加。见表3。

表3 哮喘患儿严重程度与其T2位点多态性对比

3 讨论

支气管哮喘患儿的发病因素一般与水产、牛奶、花粉、尘螨、非甾体类抗炎药、冷空气、剧烈运动、呼吸道感染等有关，是一种发作时通常有喘鸣音、呼吸时间延长、呼吸困难等症状的气道慢性炎症疾病[5-6]。支气管哮喘易感人群的修复周期较长，且修复效率较低，长时间处于炎症状态会引发气道重构，影响患儿健康[7]。临床认为尽早对支气管哮喘的遗传具体机制进行探索较为关键，ADAM33基因属于ADAM基因家族，后者在细胞信号传导、金属蛋白酶活性调控、细胞融合等方面扮演着重要角色，其中金属蛋白酶活性可破坏肺泡组织结构的完整性，降低各项肺功能指标，影响着小儿支气管哮喘发生、发展进程，经多年研究与分析，哮喘发病研究领域中ADAM33的地位得到有效确立[8]。现阶段国外研究认为其T1、M+I、F+I、V4、T2等位点基因多态性与支气管哮喘疾病的发生存在一定关联，但由于此次研究涉及遗传基因，应考虑种族人群差异的影响，加之国内汉族人口较多，有研究显示T2单核酸苷多态性与汉族支气管哮喘人群易感性存在相关性，能够对汉族患病率、病情预后及死亡率进行判断，故仅对研究深入性不足的T2位点多态性进行相关性分析[9]。

本文结果中，T2位点等位基因中，罹患支气管哮喘的高危因素是A等位基因增加。T2位点主要位于ADAM33基因的第20外显子上，碱基变化上的C由T代替，进而可将氨基酸(第774个)由Pro转换为Ser。支气管哮喘与该位点的基因多态性存在相关性，这与易感人群存在明显遗传倾向有关，种族不一的情况下其所携带的基因亦不相同，故大多属于家族史发病[9]。于水莲等[10]研究认为ADAM33基因与哮喘症状的严重程度存在一定关系，若哮喘患儿的症状越严重，那么ADAM33 mRNA的表达水平亦会相应上升，这与本文结果基本一致。本文中该位点的基因多态性与AG等位基因增加存在明显相关性，能够针对患儿的支气管哮喘严重程度进行区别，临床可基于此做好其对症用药工作，以此提升患儿的诊疗安全性。本次研究未深入分析T1、M+I、F+I、V4等位点基因与小儿支气管哮喘易感与严重程度之间的关系探讨，此为本研究不足之处，仍应于后期研究中不断探讨其相关性，以最大限度找出支气管哮喘发病与ADAM33基因存在联系的具体基因位点，进而做好风险防范工作。

综上所得，支气管哮喘与ADAM33 T2位点多态性存在相关性，其AG基因型频率、A的基因频率均会致使儿童罹患该病，临床需做好相关检测工作，以便尽早预防。