基于促黑色素合成分子的结构相似性筛选潜在白癜风的治疗药物

丁琼，于兰，罗林，黄思露，王晓琴，张波

(石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832003)

白癜风是一种常见的慢性获得性皮肤疾病，其全球发病率为0.5%～1%[1]。除了会给白癜风患者带来心理障碍外，还可能诱发甲状腺疾病[2]、缺铁性贫血[3]、银屑病[4]、感音神经性耳聋[5]等。尽管目前对白癜风发病原因的研究工作取得了一些飞跃性的进展，但是该病的确切病因及发病机制尚未阐明。

促进色素的合成对白癜风的治疗至关重要。黑色素的合成直接受酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白酶1(TRP-1)和多巴色素互变异构酶(DCT)的调控。酪氨酸酶催化L-酪氨酸羟基化为3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，是黑色素合成的关键限速酶。这些黑色素合成相关酶的表达受小眼畸形相关转录因子(MITF)的调节，在上游信号通路中，MITF可以响应α-MSH/ cAMP、Wnt和MAPK三个信号传导途径，在下游信号通路中，MITF能够指导TYR家族成员(TYR、TPR-1、DCT)在黑素细胞中的特异性表达，从而产生黑色素[6]。

目前，对白癜风的治疗主要包括NB-UVB等物理治疗，自体表皮移植等外科手术治疗，糖皮质激素，免疫调节剂，维生素D衍生物和光敏剂如8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)等药物治疗。由于药物治疗的无创性和良好的适应性，无论是白癜风稳定期还是进展期，均可为患者所接受。新药研发中基于药效基团、分子对接、定量构效关系从化合物库中筛选先导化合物逐渐受到研究者们的关注。因此，本文通过数据挖掘及文献搜索方法找出治疗白癜风的潜在化合物，根据结构相似性原理、构效关系、分子对接方法等发现可能的先导化合物并做验证以期对白癜风的治疗带来启示。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用试剂具体如下。

DMEM培养基由GIBCO公司提供；胎牛血清由杭州四季青有限公司提供；青链霉素混合液(100×)由北京索莱宝科技有限公司提供；Ermanin(纯度≥98%),Tamarixetin(纯度≥98%),8-MOP(纯度≥98%)由上海源叶生物科技有限公司提供；Quercetin 3,4’-dimethyl ether(纯度≥98%)由上海澄绍生物科技有限公司提供；MTT,DMSO，L-DOPA由美国Sigma公司提供；UNIQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒由上海生工生物工程股份有限公司提供；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Ki由美国Thermo公司提供；SYBR Green PCR Kit由德国QIAGEN公司提供。

1.2 促黑色素生成的化合物的挖掘并进行相似度评价

在PubMed中，以“vitiligo or melanin or melanogenesis”为关键词进行检索，收集报道有促进色素生成的天然产物并用orange 3.23.1软件进行层次聚类。为了整体评价药物对肝药酶的影响，本文引入肝药酶代谢整体评价模型[7]，见公式1，并利用其进行筛选，通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)的基于子结构键的2D Taimoto相似性评分来量化两个化合物之间的结构相似性并进行结构聚类[8]。

score=∑k(result)(Q)。

(1)

1.3 化合物与酪氨酸酶蛋白分子对接

分子对接参照文献并作修改[9]。从RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载酪氨酸酶(PDB ID:4P6R)蛋白pdb结构文件。运用PyMOL(https://pymol.org/2/)软件删除酪氨酸酶蛋白复合物中多余的链及水分子，分离出配体和受体，运用开源软件AutoDock Tools 1.5.6软件对其加氢，计算电荷，保存为pdbqt文件，作为对接受体。从ZINC数据库(http://zinc.docking.org/)下载化合物结构文件，小分子化合物结构文件经过加极性氢，计算电荷和添加原子类型，所有柔性键均默认可旋转等操作后，保存为pdbqt格式，作为对接配体。根据阳性药8-MOP在酪氨酸酶蛋白复合物中寻找到的最佳位点，将其坐标确定为对接的活性位点，根据其活性口袋设置Gridbox坐标及大小，采用AutoDock Vina 1.1.2进行受体-配体分子对接，并对对接结果进行可视化分析处理。

1.4 B16F10细胞培养及活力测定

将B16F10细胞培养在含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，置于含有5%CO2，37°C的湿润培养箱中培养。B16F10细胞活力测定采用MTT法，将指数生长的B16F10细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔板中过夜，用各浓度(0、4、8、16、32、64 μmol·L-1)的Ermanin(以下简称Erm),Tamarixetin(以下简称Tam),Quercetin 3,4’-dimethyl ether(以下简称Que) 3个化合物处理48 h，加入20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液并孵育4 h。吸掉培养基后，将所得的甲瓒溶于150 μL二甲基亚砜，然后将板子置于振荡器上振荡10 min，用酶标仪测定吸光度(570 nm)。

1.5 B16F10细胞内黑色素含量测定

如前所述并稍作修改[10]，将B16F10细胞以每孔1.5×105个的密度种在6孔板中培养过夜，使用临床用于治疗白癜风的化合物8-甲氧基补骨脂素(8-MOP，20 μmol·L-1)作为阳性对照，用各浓度(4、8、16 μmol·L-1)的Erm、Tam、Que及8-MOP 4个化合物处理48 h。用0.25%的胰酶消化收集于离心管中并计数，细胞沉淀加入1 mL含10%DMSO-NaOH溶液于80 ℃煮1 h,12 000 r·min-1离心10 min,取上清液100 μL置于96孔板中，每组设置6个复孔于405 nm测定吸光度。

1.6 酪氨酸酶活性测定

如前所述并稍作修改[11],以L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)氧化速率来评估酪氨酸酶活性。将B16F10细胞与Erm、Tam、Que 3个化合物及阳性药8-MOP处理48 h后，用冷PBS洗两遍，用含有1%Triton X-100的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.8)裂解，并在80 ℃冷冻60 min，然后以15 000 r·min-1离心20 min。收集150 μL蛋白质溶液置于离心管中，并使用Bradford标准测定法(BSA)对每种裂解物中的蛋白质量进行定量。每20 μL的裂解物中加入15 mmol·L-1L-DOPA于37 ℃孵育30 min,反应产物多巴色素吸光度于475 nm测定。

1.7 实时荧光定量PCR

使用UNIQ-10柱式Trizol 总RNA提取试剂盒提取总RNA，并以A260/A280、A260/A230的比例评估RNA的质量。使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA逆转为cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列及长度如表1。通过基于SYBR Green的Rotor-Gene Q(Qiagen，German)对样品中的mRNA进行分析，并使用2-ΔΔCt方法进行定量。

表1 基因引物序列

1.8 统计学分析

所有实验至少重复3次，使用SPSS 18.0和GraphPad Prism 7.0进行统计分析，运用单因素方差分析(ANOVA)进行多组比较，或使用Student′s t-test进行两组间比较，结果报告为mean ± SD。结果的显着性设置为P<0.05(*、#)，P<0.01(**)。*表示实验组与对照组比较，#表示实验组与阳性药组比较。

2 结果

2.1 潜在治疗白癜风的先导化合物

根据挖掘结果，经过整合及去重后共找到47个化合物，将这些化合物进行层次聚类，主要分为黄酮类，香豆素类，萜类等，其聚类信息如图1所示。经肝药酶代谢整体评价模型筛选后最终共收集到21个可以促进黑色素生成而有可能成为治疗白癜风的天然产物，其化合物信息具体如表2所示，结果显示主要为黄酮类化合物。

表2 化合物化学信息

右侧数字为PubChem CID号图1 挖掘出的47个促黑色素生成化合物层次聚类图

2.2 潜在治疗白癜风化合物的结构聚类图

维药驱虫斑鸠菊对白癜风的治疗有较好的疗效，其中的主要化合物分子为黄酮类，且其黄酮类化合物分子山柰素已被证明有促进色素生成[12]。此外，Thomas Walle教授证明了带有甲氧基官能团(-OCH3)的黄酮类化合物比没有甲氧基官能团的黄酮类化合物有更高的肝代谢稳定性和肠道吸收[13]。Ippei Horibe等[14]学者指出甲氧基黄酮类化合物具有更好的促黑色素效果，且4′-OCH3比-OH更能刺激黑色素的生成，3-OCH3对黑色素生成有促进作用。

因此，基于以上启示，为寻找到更有效刺激黑色素生成的化合物，拟选出Ermanin(以下简称Erm),Tamarixetin(以下简称Tam)和Quercetin 3,4′-dimethyl ether(以下简称Que)3个化合物并与该21个化合物进行结构聚类。运用PubChem数据库的基于子结构分子指纹的二维Tanimoto相似度评分量化的化合物之间的结构相似性，结果如图2所示。Erm、Tam和Que 3个化合物与这些符合Lipinski五原则的具有促进色素生成功效的黄酮化合物的2D Tanimoto相似性指数大于0.8，且与阳性药8-MOP的相似度大于0.8。

图2 3个化合物与潜在治疗白癜风化合物的结构聚类图

2.3 优选出的化合物分子与酪氨酸酶蛋白均具有较强亲和力

酪氨酸酶是黑色素合成中的关键限速酶，为了预测这些化合物对其活性的影响，我们做了分子对接。酪氨酸酶(PDB ID:4P6R)蛋白pdb晶体结构中包含的酪氨酸分子位于其活性位点中，而酪氨酸分子是酪氨酸酶结合的底物，因此，我们将酪氨酸保留在酪氨酸酶晶体结构中，以阳性药8-MOP去寻找酪氨酸酶的催化的活性位点，并以8-MOP找到的最佳活性口袋为活性位点，并将其他3个化合物分子分别对接到酪氨酸酶蛋白活性口袋中。结果如图3所示，8-MOP与酪氨酸酶蛋白结合自由能为-5.6 kcal·mol-1，结合的氨基酸残基为ASN-152和THR-156。Erm、Tam和Que 3个化合物分子与酪氨酸酶蛋白的结合位点均为ASN-152和GLY-212，与阳性药8-MOP都有共同结合残基ASN-152，这3个化合物结合自由能分别为-6.6 kcal·mol-1、-6.4 kcal·mol-1和-6.5 kcal·mol-1，且均比阳性药8-MOP低，一般认为结合自由能小于-4.0 kcal·mol-1则化合物与靶点蛋白具有较强亲和力，提示这3个化合物比8-MOP在预测的活性位点上与酪氨酸酶蛋白有更好的亲和力。

图3 化合物分子与酪氨酸酶蛋白分子对接图

2.4 优选出的化合物对B16F10细胞活力的影响

MTT的结果如图4所示。

在低浓度4、8、16 μmol·L-1下，B16F10细胞活力均在80%以上，在高浓度64 μmol·L-1时，B16F10细胞活力均在50%以下，且柽柳黄素对B16F10细胞的毒性最大。因此，在后续实验中，选择4、8、16 μmol·L-1浓度进行。

n=3，结果报告为mean ± SD图4 3个化合物的结构及对B16F10细胞活力的影响

2.5 优选出的化合物对B16F10细胞均有促进黑色素生成的能力

3个化合物对B16F10细胞色素的影响如图5所示。

给药48 h后，相差显微镜拍摄B16F10细胞形态，发现Erm给药组B16F10细胞明显变黑，且呈剂量依赖性，说明Erm能诱导B16F10细胞内黑色素积累，且16 μmol·L-1组相较于阳性药8-MOP组更黑。16 μmol·L-1的Tam组B16F10细胞相较于对照组明显变黑，说明Tam也能诱导B16F10细胞内黑色素积累。Que给药组B16F10细胞也略有变黑而无明显变化。

与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与阳性药8-MOP组比，#P <0.05；n=3。图5 B16F10细胞形态图(A，200X)、相对色素含量图(B)

B16F10细胞内黑色素含量测定结果显示，3个化合物均能促进B16F10细胞内黑色素积累，且呈剂量依赖性。其中，Erm促进黑色素积累的能力最强，且比阳性药8-MOP组促进色素积累的能力强，8 μmol·L-1、16 μmol·L-1浓度的Erm相较于阳性药组具有显著性。

2.6 优选出化合物分子增强酪氨酸酶活性

根据L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)氧化速率来评估酪氨酸酶活性的结果如图6显示。

3个化合物均能增强酪氨酸酶的活性，且呈剂量依赖性。其中，Erm增强酪氨酸酶活性的能力最强，在16 μmol·L-1时相较于阳性药组具有显著性。同时也说明，分子对接预测的结果也具有一定的可信度。

与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与阳性药8-MOP组比，#P<0.05；(n=3)。图6 酪氨酸酶活性图

2.7 RT-qPCR测定色素合成相关基因的相对表达率

实时荧光定量PCR的结果如图7显示，Erm能促进TYR、DCT及MITF基因的表达，且呈剂量依赖性。各浓度下的Erm处理组的TYR基因的表达率较阳性药组高且具有显著性。16 μmol·L-1的MITF基因表达率较阳性药组高且具有显著性。Tam处理组能促进TYR、TRP-1、DCT及MITF基因的表达且均呈剂量依赖性，16 μmol·L-1的Tam处理组的TYR基因表达率相较于阳性药组高且具有显著性。16 μmol·L-1的Que处理组的TYR及DCT基因相较于对照组具有显著性。

与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与阳性药8-MOP组比，#P<0.05;n=3。图7 RT-qPCR显示与黑色素生成相关基因TYR、TRP-1、DCT及MITF基因的相对表达率

3 讨论

白癜风的发病机制复杂，研究者们对其发病机制提出了各种假说，主要涉及遗传学说，精神-神经学说，自身免疫学说，氧化应激学说，锌-α2-糖蛋白(Zinc-α2-Glycoprotein)缺乏学说，病毒学说，黑素细胞自身破坏学说等[15]。由于其机制的复杂性，尚无安全有效能治愈白癜风的药物。因而治疗白癜风的先导化合物的开发及研究具有重大意义。

其中，潜在治疗白癜风的先导化合物的模拟预测对于药物开发至关重要，可能会大大增加准确性及减少投入成本，合理药物设计即基于结构的药物设计，它应用受体结构的有关知识，来指导和辅助药物分子的设计[16]。而基于受体的结构相似性原理也受到了研究者们的热捧，即相似的药物可能会有相似的功效，虽然有的药物相似性很高却功效稍有差别或者是完全相反，但是结构性相似性原理在药物预测中仍然存在极大的意义并引导着研究者们开发新药[17]。我们使用了来自PubChem数据库的基于子结构键的二维Tanimoto相似度评分来量化化合物之间的结构相似性，其原理是PubChem将化合物生成二进制指纹，以表示每种化合物是否存在特定的化学亚结构,其Tanimoto分数始终在0到1之间，在95%的显着性水平上，Tanimoto分数为0.68或更高具有统计学意义[8]。在我们的实验中，我们运用PubChem根据候选化合物的分子指纹特征，将他们进行结构聚类，每个聚类簇的化合物都具有相似的属性，Ermanin,Tamarixetin,Quercetin 3,4′-dimethyl ether 3个化合物与药性药8-MOP的 2D Tanimoto相似性指数大于0.8，其相似性指数具有统计学意义。

分子对接是一种将配体放入其受体结合位点的计算方法。它的本质是已知受体(一般为蛋白)大分子和配体小分子的结构以及在受体大分子的对接位点和空间范围，获得配体小分子与大分子靶标在结合位点结合的各种构象，并对各个构象进行能量值打分，找到配体小分子和受体大分子结合的最优构象，得到最佳的对接[18]。3个化合物及阳性药与酪氨酸酶蛋白活性位点的分子对接结果也显示其结合能均小于-4 kcal·mol-1，其与酪氨酸酶蛋白的亲和力较高。在后续的酪氨酸酶活性测定中也证明了这一点，3个化合物均能增强酪氨酸酶的活性。

通过黑色素含量测定实验发现，这3个结构相似的化合物均能增加黑色素的含量，且Erm化合物促进黑色素生成的效果最好，Tam次之，Que相对较差，其结果的差异对我们探索构效关系也有一定的启示，三者在结构上有3处不同点，即3位，3′位和4′位，结合前人的研究[19]，黄酮结构4′-OCH3比-OH更能刺激黑色素的生成，3′位-OH存在时，3位-OCH3的存在对色素合成有消极影响。

本实验采用的模型为B16F10细胞，为黑色素瘤细胞，虽已被大量的研究者们用于促黑色素生成的药物筛选[20]，对于药物筛选具有廉价，方便，快捷的特点，虽有一定的可取性，但是后续模拟白癜风并对其机制进行评价时，可能C57BL/6小鼠及其原代黑色素细胞，斑马鱼等更合适。

3个化合物分子均能上调TYR基因的表达，尤其是16 μmol·L-1Erm和16 μmol·L-1Tam，其TYR基因的上调倍率分别是4.2倍和3.3倍；与酪氨酸酶蛋白的分子对接显示其与该蛋白的结合能分别为-6.6 kcal·mol-1,-6.4 kcal·mol-1，比阳性药8-MOP的结合能-5.6 kcal·mol-1低；此外，酪氨酸酶的活性也呈剂量依赖性增加，基于这些线索，Erm和Tam可能是直接增强酪氨酸酶的活性而促进黑色素生成。

在后续白癜风先导化合物的发现中有几个值得探索的方向。首先关于化合物的结构相似性评分，我们在此使用了化合物2D结构信息，因为其在预测中产生较好的结果(Molecular similarity in medicinal chemistry)。后续若可以获得更准确的化合物3D结构可靠的3D结构相似性指标时，我们可以基于3D结构进行相似性分析，其结果可能更具准确性。其次，已初步验证了这3个化合物有促进色素生成的作用，这3个化合物能否成为治疗白癜风的化合物需要后续更深入的研究。