人源JAZF1基因真核表达载体的构建及其对胚胎癌细胞凋亡的影响

2021-03-05杨诚诚

四川农业大学学报 2021年1期

陈倩，李超，杨诚诚，母彬，龚欢，黄超

（四川农业大学动物医学院，实验动物疾病模型研究室，成都 611130）

锌指蛋白（zincfinger protein，ZNF）属于转录调控因子，具备特别的锌指模体结构，具有种类多、存在普遍性的特征。锌指并列基因1（Juxtaposed With AnotherZincfingerGene1，JAZF1）又称 ZNF802、Tip27，其相对分子质量约为2.7×104，属于锌指核蛋白，在小鼠和人中有着较高的保守性[1]。研究者们发现JAZF1基因作为睾丸孤核受体（testicular orphan nuclear receptor 4，TR4）的竞争抑制型调控因子[2]，对雄性哺乳动物的生殖活动调控作用重大[3-4]；全基因组关联研究已确定JAZF1与糖脂代谢的关系[5-7]；亦有少量研究表明，JAZF1参与甲状腺乳头状癌[8-9]、非病毒性肝细胞癌[10]、前列腺癌[11]等肿瘤的进展。然而JAZF1对胚胎癌发展的影响仍未可知。

胚胎癌（embryonal carcinoma，EC）由生殖细胞前体发育异位产生，具有胚胎发育多能性，是各种肿瘤中唯一具有野生型基因组的非典型恶性肿瘤[12]。胚胎癌主要发生于人体性腺或中枢神经系统等人体中线等部位[13-14]。EC或具有EC成分的生殖细胞肿瘤常见于20～35岁的年轻人，也可发生于数月至2岁大的婴幼儿。其恶性程度往往高于其他生殖细胞肿瘤成分，5年生存率仅为44%[15]。由于EC较为罕见，临床病理特点复杂，目前鲜见相关研究报道。NCCIT是代表EC肿瘤的细胞系之一[16]，具有与胚胎干细胞相似的基因表达谱，原则上可以分化为几乎所有的组织谱系，能作为研究初期胚胎发育和肿瘤发生的优良模型[17]。综上所述，JAZF1作为新发现的多功能基因，研究者对其了解较少，而JAZF1对胚胎癌的影响更是鲜有报道。因此，本试验主要通过构建pRK5-myc-JAZF1重组质粒，初步了解JAZF1在NCCIT细胞生存中发挥的作用，为进一步研究JAZF1基因在胚胎癌中的生物学功能及其作用机制提供基本依据。

1 材料和方法

1.1 主要试验材料

人胚胎癌细胞NCCIT购自中国科学院上海生物科学研究所。pRK5-myc质粒、大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α、DNA Marker DL5000、限制性核酸内切酶SalⅠ、限制性核酸内切酶NotⅠ、PrimeSTAR Max预混合物（2×）、10×QuickCut Green缓冲液、RNAiso Plus、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（TliRnaseH Plus）购自宝生物工程（大连）有限公司。反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、TransEasyTM转染试剂均购自成都福际生物技术有限公司。DAPI封闭剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒（E.Z.N.A.Gel Extraction Kit）购自北京天根生化科技有限公司。RNA抽提试剂盒购自Invitrigen公司。质粒抽提试剂盒（Plasmid Mini KitⅠ）购自美国OMEGA公司。

1.2 引物的设计与合成

借助GenBank数据库下载JAZF1基因（Gene ID：221895），利用引物设计软件，设计一对JAZF1基因特异的PCR引物，上游引物为5’-CATATATACG CGTCGACTATGACAGGCATCGCC-3’，下游引物为5’-TTGCGGCCGCTTATTGCTGCATCTTCCTGATA-3’。IL1-β上下游引物分别为5’-ACCAAACCTCTT CGAGGCAC-3’和 5’-CGAGCTCAGGTACTTCTGCC-3’、IL8上下游特异性引物分别为5’-AGCCAGATG CAATCAATGCC-3’和 5’-AATTTCTGTGTTGGCGCA GTG-3’、TGF-β 上下游特异性引物分别为 5’-AAGGACCTCGGCTGGAAGTG-3’和 5’-CCCGGGCC ATGCTGGTTGTA-3’。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 扩增目的基因片段

使用RNA抽提试剂盒从NCCIT细胞中抽提RNA并反转录cDNA，然后用PCR仪扩增JAZF1基因。在1%浓度的琼脂糖凝胶中进行电泳，分离PCR产物，与DNA Marker DL2000比较，筛选出长度约为850 bp、浓度较高、特异性强的产物，割取对应条带，使用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收。

1.4 构建pRK5-myc-JAZF1重组质粒并测序

用SalⅠ、NotⅠ对胶回收产物和pRK5-myc质粒分别进行双酶切，在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳，对酶切产物进行检测并进行胶回收，用T4连接酶连接，构建重组质粒pRK5-myc-JAZF1，然后转化进E.coli DH5α感受态中。挑斑，接种到LB培养液（内含氨苄青霉素）中扩增，并用质粒提取试剂盒提取质粒。用NotⅠ和SalⅠ双酶切筛选出浓度较高的阳性重组质粒，送往擎科生物科技有限公司测序。

1.5 转染NCCIT细胞

将NCCIT细胞培养于含DMEM培养基的6孔板中，当细胞密度到达视野的2/3左右时，将重组质粒pRK5-myc-JAZF1和空载体pRK5-myc分别转染至NCCIT细胞中。转染完毕后于37℃、5% CO2条件下培养，4～6 h换液。培养36 h后，进行后续实验。

1.6 检测转录水平

提取转染细胞的RNA，经反转录以获得cDNA。用实时荧光定量PCR扩增这些cDNA，qRT-PCR（20μL）程序设置：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30 s，共进行39个循环。设立内参h-βactin，检测转录调控因子JAZF1及炎性因子IL1-β、IL8、TGF-β 的转录水平。

1.7 检测NCCIT细胞凋亡情况

用多聚赖氨酸预处理6孔板中的盖玻片，24 h后清除液体并铺入细胞。细胞密度达到视野的2/3左右，即可转染重组质粒pRK5-myc-JAZF1，空载体pRK5-myc以同样的方法转染作为对照组。36 h后吸出六孔板中的培养液并用PBS清洗，然后用DAPI染色封闭剂处理，封片完毕后，室温避光放置24 h后观察结果。

1.8 处理分析试验数据

采用SPSS 22.0处理数据，采用作图软件Adobe Photoshop CS6处理图片。P＜0.01为极显著，在统计图中以**表示；P＜0.05为显著，以*表示。

2 结果与分析

2.1 JAZF1基因扩增结果

从人胚胎癌细胞NCCIT中提出RNA，经反转录获得cDNA，并以此为模板扩增JAZF1序列。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，泳道呈现约800 bp的单一明亮条带（图1），与预期JAZF1基因的条带大小几乎一致。

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 重组质粒的鉴定

仔细挑取单菌落，经扩增后提取质粒。用SalⅠ和NotⅠ对质粒进行双酶切，电泳显示2条线性条带：一条为大小约800 bp的条带（图2），与预期的JAZF1片段大小基本相符，另一条为大小约5 000 bp的条带，与pRK5-myc质粒大小（5 000 bp）基本一致，表明目的基因与质粒已成功连接；将所测序列与GenBank中JAZF1基因序列进行比对分析，结果证实插入的DNA片段与人源JAZF1基因的编码序列完全一致（图3）。证明成功将JAZF1基因重组到pRK5-myc质粒上，构建了人源JAZF1真核表达质粒。

图2 pRK5-myc-JAZF1重组质粒双酶切鉴定图Figure 2 Electrophoretogram of recombinant plasmid pRK5-myc-JAZF1 using double enzyme digestion

图3 pRK5-myc-JAZF1重组质粒DNA测序结果Figure 3 Sequencing results of recombinant plasmid pRK5-myc-JAZF1

2.3 qRT-PCR检测JAZF1基因及炎性因子mRNA表达水平

转染重组质粒pRK5-myc-JAZF1的NCCIT细胞中，JAZF1的mRNA表达水平极显著升高（图4A），证实了重组质粒转染NCCIT细胞后极显著上调了JAZF1基因的转录水平。检测过表达JAZF1基因的NCCIT细胞中炎性因子的转录水平，结果表明：过表达JAZF1基因后，促炎因子IL1-β和IL8的转录水平明显下降（图4B-C），而抑炎因子TGF-β的转录水平无明显改变（图4D），这提示JAZF1的过表达在NCCIT细胞中具有抑炎作用。

图4 JAZF1基因及炎性因子mRNA表达水平（n=3）Figure 4 mRNA level of JAZF1 and inflammatory factor（n=3）

2.4 过表达JAZF1基因对NCCIT细胞凋亡的影响

转染后，两组细胞均发生不同程度的凋亡，其中转染空载体的NCCIT细胞存活更多（图5），而转染pRK5-myc-JAZF1的NCCIT细胞出现了包括染色加深、染色质固缩和大量细胞核裂解等现象在内的更明显的凋亡（图6）。随机选取7个视野，统计并比较细胞凋亡率（图7），结果显示过表达JAZF1基因的NCCIT细胞凋亡率更高（P＜0.01），表明上调JAZF1基因的转录水平能促进NCCIT细胞凋亡。

图5 转染空载体组的细胞凋亡情况（n=7）Figure 5 Apoptosis in the empty vector group（n=7）

图6 转染重组质粒组的细胞凋亡情况（n=7）Figure 6 Apoptosis in the recombinant plasmid group（n=7）

图7 空载体组和重组质粒组的细胞凋亡率情况（n=7）Figure 7 Cell apoptosis rate in empty group and transfected pRK5-myc-JAZF1 recombinant plasmid group（n=7）

3 讨论

近些年来，随着分子生物技术的快速发展，研究者们相继对JAZF1展开研究，发现JAZF1基因作为广泛表达于机体的核转录因子，在哺乳动物生理活动中发挥重要作用。多项研究[18-21]表明过表达JAZF1基因能够抑制 TNF-α、IFN-γ、MCP-1 及 IL17 等促炎因子的表达及释放，并相应上调IL4等抑炎因子的相对表达量。我们的研究结果与先前的报道相符，初步证实JAZF1在NCCIT细胞中的抑炎作用，说明JAZF1在抑制机体炎症中发挥重要作用。

此外，JAZF1能影响细胞增殖和凋亡，这能对肿瘤进展及细胞损伤性疾病等发挥重要作用。K.Bae等[22]发现上调JAZF1基因转录水平会引起心力衰竭症状。Huang L.等[9]发现 JAZF1 可以抑制 TAK1/NF-κB通路，从而诱导甲状腺乳头状癌细胞BCPAP凋亡，影响细胞增殖，提示JAZF1可作为甲状腺乳头状癌的分子标记。本试验的体外研究发现，过表达JAZF1后，NCCIT细胞出现核浓缩、核碎裂和核溶解等典型的凋亡形态，核内可见浓染的蓝色颗粒状强荧光。过表达JAZF1后，NCCIT细胞的凋亡率为12.5%，极显著大于转染pRK5-myc的空载体对照组，证实过表达JAZF1可促进NCCIT细胞凋亡，从而抑制胚胎癌增殖。

许多研究阐述了炎症与肿瘤的发生发展之间存在的相关性[12]。例如慢性肝炎能诱发肝癌，NF-κB信号通路是得到证实的转导通路之一[23]；遗传性显性等位基因突变引发的家族性胰腺炎会引发胰腺癌[24]；而阻断炎症细胞内的IKK信号通路可以有效抑制结肠癌的形成等[12]。试验中，过表达JAZF1能够明显抑制促炎因子IL1-β、IL8的转录水平，促进NCCIT细胞凋亡，推测JAZF1可能通过抑制炎症的发生来促进NCCIT细胞凋亡，从而抑制胚胎癌进展。许多研究者对JAZF1在炎症和癌症等方面的作用机制开展研究，Huang L.等[8]研究推测JAZF1通过调节睾丸孤儿核受体TR4来激活NF-κB信号通路，从而在甲状腺癌中发挥作用。胡文静等[19]研究发现JAZF1直接或间接抑制高脂诱导的小鼠肝组织p38 MAPK、JNKs和NF-κB激酶的激活程度，从而抑制促炎因子IL-8、MCP-1及TNF-α的产生。Sung Y.等[25]发现JAZF1通过调节JNK/Slug信号来促进前列腺癌的进展和转移。尽管获得了上述结果，但JAZFl所在的炎症信号转导通路及抑制胚胎癌增殖的具体作用机制尚不明确，亟待下一步深入研究证实。