精料补充料补饲对藏羔羊生长发育及瘤胃菌群组成的影响

周 力，马博妍，高占红，姚有莉，王志有，桂林生

（青海大学农牧学院，西宁 810016）

羔羊具备生长发育快和可塑性强等特点[1]。但由于羔羊的生理机能尚未发育完全，日常饲喂管理稍有疏忽不仅会影响羔羊的生长发育和体质，造成死亡率增加，还会影响成年期的体型结构和生产性能。尤其是在青藏高原地区，该地区平均海拔4 000 m，严酷的自然环境和气候条件导致牧草生长期较短，枯草期长达7个月之久[2]，故高寒以及母羊营养摄入匮乏是造成藏羔羊死亡率高、出栏率低的主要因素。因此，通过营养调控减少幼畜死亡率，提高生产性能是高原畜牧业研究热点之一。

瘤胃微生物能够将反刍动物摄入的高纤维日粮进行发酵和分解，形成挥发性脂肪酸为宿主吸收[3]，同时可以将植物性蛋白质和非蛋白氮转化为微生物蛋白[4]，甚至宿主所需的B族和K族维生素也主要来源于微生物的合成[5]，可见瘤胃微生物与反刍动物的生长发育和免疫功能密切关联。前期研究证实，幼龄羔羊瘤胃微生物菌群发育受诸多因素影响，如遗传[6]、日粮[7]、年龄[8]及外界环境[9-10]。早期瘤胃微生物区系尚未完全建立，易受日粮类型及组成变化的影响，进而直接决定宿主的机体代谢、免疫等机能[11]。因此，结合青藏高原特有的生态环境，在保证瘤胃内环境稳定的基础上，对藏羔羊进行科学补饲以满足其生长发育需求具有一定的实际生产意义。

基于此，本研究拟通过16 S rDNA高通量测序技术，在微生物角度上阐述精料补饲对藏羔羊生长发育、瘤胃菌群组成的影响，为促进其生产力提供理论依据和技术途径。

1 材料和方法

1.1 试验动物

选择年龄相近的健康断奶藏羔羊200只（断奶日龄为 60 d），随机分为试验组（T）和对照组（CK），每组100只。试验时间为2019年3月—6月。养殖地点位于青海省海南州同德县河北乡黄河村。

1.2 试验设计

母羊同期发情，集中配种，集中产羔，藏羔羊60 d断奶，断奶后持续育肥。对照组藏羔羊全程放牧饲喂，试验组藏羔羊在放牧基础上，第1周归牧后每天每只藏羔羊初始补饲0.2 kg/d精料补充料，此后每周增加50 g精料补充料，每隔一周调整一次日粮，试验期为120 d。对照组归牧进入圈舍后不进行补饲。所有试验羊放牧草场条件一致，自由饮水，归牧时间为每天19:30。根据藏羊当地饲养的实际情况以及参照我国《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）进行日粮的配制，其日粮组成和营养水平见表1。

表1 试验日粮组成和营养水平（干物质）Table 1 Ingredients and chemical composition of the experimental diets（DM）%

1.3 样品采集

试验结束后，从试验组和对照组中随机选择5只藏羔羊颈静脉放血屠宰后，采集瘤胃内容物于无菌离心管中，3 500 r/min离心15 min，取上清液混匀后通过4层纱布过滤，置于-80℃备用。同时，试验期内，每月测定所有藏羔羊体重、体高、体长及胸围等生长发育指标。

1.4 16s rDNA PCR扩增

1.5 数据分析

SPSS 15.0统计软件中采用t检验比较2组数据的显著性差异，数据以平均值±标准差（mean±SD）表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 精料补饲对藏羔羊生长发育的影响

由表2可知，在试验第30天与第60天羔羊的体重，试验组显著高于对照组（P＜0.05），而在试验第90天、第120天羔羊的体重和整个试验全期平均日增重，试验组极显著高于对照组（P＜0.01）。

表2 精料补饲对藏羔羊增重的影响Table 2 Effect of concentrate supplementation on weight gain of Tibetan lambs

由图1可知，精料补饲在试验期第60天时能显著提高藏羔羊体斜长和胸围（P＜0.05），另外在第120天能显著提高藏羔羊的体斜长（P＜0.05）。

图1 精料补饲对藏羔羊体尺指标的影响Figure 1 Effect of supplementary feeding with concentrate on body size index of Tibetan lamb

2.2 测序结果

10份藏羔羊瘤胃液样本中总共获得原始序列825 481条，其中有效序列818 295条，序列度盖度为99.13%。Shannon稀释曲线在数据量为5000以上时呈现平缓趋势，表明测序深度及数据量趋于饱和（图2-A）。相似度大于97%的有效序列聚类为3366个OTU，其中2 192个OTU为2组藏羔羊共有，576个OTU为对照组独有，598个OTU为试验组独有（图2-B）。

图2 样品稀释曲线（A）和OUT韦恩图（B）Figure 2 Rarefaction curve of sample(A)and OTUs Venn diagram(B)

2.3 瘤胃细菌相对丰度

由表3可知，在门水平下，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）以及疣微菌门（Verrucomicrobia）相对丰度较高，分别占细菌总量的56.68%，17.80%以及12.81%，为优势菌门。通过对比排名前10菌门的差异发现，2组藏羔羊瘤胃细菌的3个优势菌门差异并不显著（P＞0.05）。

表3 门水平下瘤胃细菌相对含量Table 3 Relative bacterial content at Phylum level

由表4可知，在属水平上，普雷沃菌属_1（Prevotella_1）、理研菌科 RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、普雷沃氏菌科 _UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、普雷沃氏菌科 _UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）和瘤胃球菌科_UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）为藏羊瘤胃微生物优势菌属，比例分别为21.77%，10.45%，3.88%，2.37%和2.06%。通过对比2组的优势菌属发现，对照组的瘤胃球菌科_UCG-014的丰度显著高于试验组（P＜0.05）。

表4 属水平上瘤胃细菌相对含量Table 4 Relative bacterial content at genus level

2.4 瘤胃微生物Alpha多样性

应用t检验法对Alpha多样性中Chao1、Ace、Shannon和Simpson等指数进行分析，表5结果显示，对照组的Chao1指数和Ace指数显著高于试验组（P＜0.05）。Shannon指数和Simpson指数方面，2组之间差异不显著（P＞0.05）。

表5 瘤胃细菌Alpha多样性指数Table 5 Alpha diversity indexes of rumen bacteria

2.5 瘤胃细菌Beta多样性

基于Unifrac算法在 OTU水平上对瘤胃细菌进行 Principal co-ordinates analysis（PCoA），图 3-A结果显示，2组藏羊聚类明显，说明精料补饲对藏羔羊瘤胃细菌区系存在具有显著的影响。此外，对2组藏羔羊样本进行Nonmetric Multidimensional Scaling（NMDS）分析，结果进一步佐证了2组藏羔羊瘤胃细菌区系差异明显（图3-B）。

图3 Beta多样性分析Figure 3 Analysis of Beta diversity

2.6 功能预测

利用Tax4Fun软件进行KEGG Pathway的功能性注释，结果如图4所示，2组藏羔羊瘤胃微生物主要富集于碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、信号转导（signal transduction）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）、核苷酸代谢（nucleotide metabolism）、辅因子和维生素代谢（metabolism of cofactors and vitamins）、能量代谢（energy metabolism）、翻译（translation）等功能通路。

3 讨论与结论

3.1 精料补饲对藏羔羊生长发育的影响

青藏高原恶劣的气候环境导致枯草期长达7个月，而刚断奶的羔羊营养摄入需求最为旺盛，因此科学补饲是维持羔羊生长发育必不可少的生产环节[12]。殷雨洋等[13]研究发现，补饲颗粒饲料能够促进断奶羔羊的体重和干物质采食量、改善羊肉品质，同时增加湖羊养殖经济效益。此外，通过对比自然放牧与放牧补饲的2组杂交羊发现，精料补饲能够显著促进羔羊生长发育速度，同时提高胴体重、屠宰率以及净肉率等屠宰性能[14]。本研究中，放牧基础上补饲精料补充料，不仅能够提高藏羔羊的体重，还能显著增加其体高和胸围等生长发育指标，这与上述研究结果基本一致。推测可能存在2方面原因，首先幼龄反刍动物早期补充精料补充料能够改变其肌肉中能量代谢相关基因的表达水平，有助于提升成肌细胞的增殖潜力以及肌肉增长速度[15]。其次，补饲精料补充料为瘤胃微生物提供更为充足的碳源和氮源，维持瘤胃的正常功能，保证宿主对营养物质的消化与吸收效率[16]。

3.2 精料补饲对藏羔羊瘤胃细菌菌落丰度的影响

本试验通过多样性分析发现对照组的Chao1指数和Ace指数显著高于试验组，说明对照组藏羔羊瘤胃细菌较处理组丰富。Li R.H.等[17]发现，高精料补充料日粮能够显著提高荷斯坦奶牛瘤胃OTUs数量，同时降低细菌α多样性中Chao1指数和Ace指数[18]。此外，荷斯坦母牛日粮中精料比例与瘤胃中总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA）、NH3-N含量以及细菌Chao1指数呈现负相关关系[19]。这与本研究结果基本相似，尽管日粮中精料补充料能够为瘤胃微生物提供更多的蛋白以及碳水化合物，维持其生长量需求[20]。但是，伴随着精料补充料的增加，非结构碳水化合物同样会随着增加，导致瘤胃产生乳酸和挥发性脂肪酸的大量生成，一定程度上降低了pH值，抑制瘤胃中酸敏感菌落的活性[21]。

图4 KEGG注释分布图Figure 4 Distribution graph of KEGG annotation

3.3 精料补饲对藏羔羊瘤胃微生物菌落结构的影响

反刍动物与瘤胃微生物之间为共生关系，宿主为瘤胃微生物的生长发育提供合适的内环境以及营养物质，而微生物则将高纤维饲料发酵分解为诸多营养物质，为宿主吸收利用[22]。基于16 SrDNA高通量测序技术，本研究结果揭示，藏羔羊瘤胃微生物优势菌群分别是拟杆菌门和厚壁菌门，其相对丰度分别为56.68%和17.80%。结果与Liu K.Z.等[23]在山羊瘤胃微生物的研究结果一致。研究证实，细菌源瘤胃纤维素酶主要来源于瘤胃球菌，能够吸附并降解饲料中植物细胞壁，有效提升高纤维含量饲料的利用率[24]。以荷斯坦奶牛为研究目标，Wang L.J.等[25]证实，日粮中精料补充料能够显著降低瘤胃细菌中瘤胃球菌科_UCG-014的相对丰度，与本研究结果一致。我们推测粗纤维构成的日粮能够为瘤胃球菌提供更多且更有效的结合基质。这可能与瘤胃球菌能够产生淀粉酶和纤维素酶等降解酶，用于破坏粗纤维细胞壁，更好地实现对碳水化合物分解发酵有关。

综上，精料补充料补饲能够显著提高藏羔羊的平均日增重，此外，尽管精料补充料补饲会造成藏羔羊瘤胃细菌的丰富度的降低，但对瘤胃优势菌群门水平的相对丰度并无显著影响，这说明适量补饲精料补充料在不影响羔羊瘤胃微生物区系的基础上，能更好地发挥其生产性能。