基于DIALC-MS的烟草根尖蛋白质样品检测分析

莫泽君 陈小翔 蒲媛媛 段丽丽 田宗林 滕建辉 罗雯 阙远慧 刘仁祥

基于DIA LC-MS的煙草根尖蛋白质样品

检测分析

莫泽君1，2，陈小翔3，蒲媛媛1，2，段丽丽1，2，田宗林2，4，滕建辉2，4，

罗 雯2，4，阙远慧2，4，刘仁祥2，4*

（1贵州大学农学院 贵阳 550025;2贵州省烟草品质研究重点实验室，贵阳 550025;3浙江中烟工业有限责任公司，

杭州 310000;4贵州大学烟草学院，贵阳 550025）

摘要：【目的】分析数据非依赖性采集高分辨率色谱—质谱技术（DIA LC-MS）对根尖差异蛋白质样品检测的适用性，为深入研究烟草蛋白质组学提供技术支撑。【方法】以6个烟草品种（系）移栽后74 d的根尖组织为试验材料，采用DIA LC-MS法对裂解的蛋白质肽段进行扫描，从而分析该方法对根样组织的适用性。【结果】采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖总蛋白质，能得到横向条带平行性好，电泳条带清晰的蛋白质样品，样品等级评价均达到A级。构建的DDA数据库包含28042条肽段，共鉴定出7084个蛋白质。DIA数据的色谱峰平均数据点为7，平均的峰容量达260，主要肽段的保留时间（iRT）均被检测出，且整体较稳定，在Q值为0.01标准下的一致性评分（Cscore）为0.948，变异系数（CV）中值为11.5%（小于20.0%），相关系数大于0.9。DIA全息扫描模式下从6个烟草品种（系）的根尖组织中鉴定出的蛋白质数目为4149～5069个。【结论】DIA LC-MS分析鉴定的蛋白质范围广、数量大、可信度高，具有一定的可靠性和稳定性，各项质控指标均能达到试验分析要求，说明DIA LC-MS适用于烟草根尖蛋白质组样品的检测分析。

关键词： 烟草;DIA LC-MS;根尖;蛋白质;检测;适应性

中图分类号：S572.035.3                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）11-2962-07

Detection and analysis of protein samples of tobacco root tip tissue based on DIA LC-MS

MO Ze-jun1，2， CHEN Xiao-xiang3， PU Yuan-yuan1，2， DUAN Li-li1，2， TIAN Zong-lin2，4，TENG Jian-hui2，4， LUO Wen2，4， QUE Yuan-hui2，4， LIU Ren-xiang2，4*

（ 1College of Agricultural， Guizhou University， Guiyang  550025， China; 2Key Laboratory of Tobacco Quality in Guizhou Province，Guiyang  550025， China; 3Zhejiang Zhongyan Industry Co.，Ltd.， Hangzhou  310000， China; 4College of Tobacco，Guizhou University， Guiyang  550025， China）

Abstract：【Objective】The applicability of data-independent acquisition high-resolution chromatography-mass spectrometry （DIA LC-MS） for the detection of differential protein samples in root tips was analyzed to provide technical support for in-depth study of tobacco proteomics. 【Method】The root tip tissue of 6 tobacco varieties （lines） was used as the test material at 74 d after transplantation， and the cleaved protein peptides were scanned by DIA LC-MS method to analyze the applicability of this method to root-like tissue. 【Result】The total protein of root apex was extracted by TCA/acetone precipitation + SDT lysis method， and protein samples with good parallelism of horizontal bands and clear electrophoresis bands were obtained， and the sample grade evaluation all reached grade A.The constructed DDA database contained 28042 peptides， and a total of 7084 proteins were identified. The average chromatogram peak of the data was 7， the average peak capacity was 260， the main retention time（iRT） was detected， and the retention time was generally stable， the consistency score（Cscore） was 0.948 under the Q value of 0.01 standard， the median coefficient of variation（CV） was 11.5% （less than 20.0%）， and the correlation coefficient was greater than 0.9. The total number of proteins identified from the root tip tissue of six tobacco varieties （lines） under DIA holographic scanning mode ranged from 4149 to 5069.【Conclusion】The proteins identified by DIA LC-MS analysis have a wide range， a large number， high relia-bility， and certain reliability and stability. All quality control indicators can meet the requirements of experimental analysis， indicating that DIA LC-MS is suitable for detection and analysis of proteomic samples from tobacco root tips.

Key words： tobacco; root tip tissue; protein; DIA LC-MS; detection; adaptability

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32060510）; Science and Technology Department Project of Guizhou （〔2016〕5663）;Science and Technology Department Project of Guizhou （〔2019〕1405）

0 引言

【研究意義】烟草是广泛栽培的特种经济作物，也是遗传背景较清晰的模式植物（刘强等，2020）。烟草根系作为烟株最重要的器官之一，对烟草的生长发育起着至关重要的作用（张玉涛等，2012;张琳等，2019）。随着现代生物技术的不断发展，从整体水平上研究生物体内的蛋白质组成及其生命活动规律，已成为了解基因功能的另一新途径（韩平安，2016）。因此，探索烟草根尖蛋白质样品的提取方法及质谱定性和定量检测技术，对于从蛋白质水平寻找烟草根组织的生物标志物质，研究烟草生命活动规律具有重大意义。【前人研究进展】近年来，质谱仪器可按照数据非依赖性采集（DIA）的形式进行扫描，实现高通量检测和质谱绝对定量（Tsou et al.，2015;牟永莹等，2017;Demichev et al.，2020）。张译元等（2021）基于DIA技术对转IGF-I基因细毛羊皮肤组织进行蛋白组学分析，结果筛选出18个与羊毛性状相关的差异蛋白及8条与羊毛生长发育相关的信号通路，为探明羊毛性状的分子调控机理及分子标记育种提供参考依据。Guo等（2015）采用PCT-DIA技术将来自9个肾癌病人的18个组织切片分别转化为DIA多肽离子碎片谱图，并根据谱图对2000个蛋白样本进行定性和定量分析，结果发现肾组织切片的蛋白质组测序结果具有很好的重复性，而且能完全将肾癌病人和健康人，以及不同组织形态的肾癌亚型区分开来。Yu（2019）通过DIA技术和抗体微阵列技术，对银屑病治疗前、银屑病中药治疗后、健康对照共50例血清样本建立蛋白质表达谱，结果鉴定出106种参与血液凝固、炎症、细胞凋亡和血管生成等银屑病相关生物过程的差异蛋白，其中58种蛋白可区分健康组和银屑病患者，12种蛋白可预测中药治疗效果，3个血清蛋白与银屑病面积和严重程度指数评分呈正相关。可见，DIA技术的发展对生物标志物的筛选具有重大意义。但对于植物根系的蛋白质提取及分析多采用数据依赖性采集（DDA）的扫描方式（肖爽，2020），该方法存在扫描粗犷，覆盖率低，样品数据质量偏低等问题，难以满足试验需求（王震，2016）。【本研究的切入点】烟草作为生物技术研究的模式植物，但目前鲜见应用数据非依赖性采集高分辨率色谱—质谱技术（DIA LC-MS）方法分析根系蛋白质组表达情况的研究报道。【拟解决的关键问题】以6个烟草品种（系）的根尖组织为试验样品，采用DIA技术对裂解的蛋白质肽段进行扫描分析，探讨DIA LC-MS法对根样组织的适用性，为深入研究烟草根系的蛋白质组学提供更高效分析方法。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

选用K326、青梗、Va116、Basma、K326×青梗和Va116×Basma为试验材料，由中国农业科学院烟草研究所提供。主要试剂：BCA蛋白浓度测定试剂盒（5000201）购自Bio-Rad公司;胰蛋白酶（V5113）购自Promega公司;iRT试剂盒（Ki-3002-2）购自Biognosys公司。主要仪器设备：高效液相色谱（LC-10AT）购自Shimadzu公司;安捷伦多重亲和力去除系统（1200）购自Agilent公司;EASY-nLCTM1200纳米液相色谱系统（LC140）和Q-Exactive HF-X识别系统（EXR0726042）购自Thermo公司;EASY-SprayTM C18色谱柱（ES802A）购自Thermo Scientific公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 田间试验 田间试验于2019年在贵州大学烟草科研基地开展。当年2月25日播种，5月1日移栽至大田，采用随机区组设计，设置3次重复，每小区3行，每行15株，共45株，行株距：110 cm×55 cm。大田管理措施与当地优质烟栽培措施一致。移栽后74 d进行取样，取样部位为烟草幼嫩根尖。每小区随机取3株混合，为避免外源污染，用纯净水清洗干净后，再用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。根尖样品等量均匀混合后，置于不同灭菌离心管中，先用液氮冷冻，并立即置于-80 ℃低温冰箱保存。

1. 2. 2 蛋白质样品制备 蛋白质样品的制备采用TCA-丙酮沉淀法。具体操作参见Thierry（2002）、范龙泉等（2012）的方法进行。

1. 2. 3 蛋白质浓度测定 参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白质浓度测定。

1. 2. 4 蛋白质酶解及肽段浓度测定 参照李升升（2019）、徐昊（2019）的方法进行蛋白质酶解。采用紫外光吸收法（280 nm）测定肽段浓度。取100 μg高丰度分离后的低丰度肽段，采用HPRP方法进行分级，收集所有组分。每个组分肽段冻干后，用10 μL 0.1% FA复溶肽段，并测定肽段浓度。然后分别取出2 μg肽段，掺入适量保留时间（iRT）标准肽段进行DDA质谱检测，每个组分质谱分析时长90 min。

1. 2. 5 质谱检测方法 DDA分析采用纳升流速HPLC系统Easy nLC-1200进行色谱分离。质谱检测及DIA分析参照周淦（2016）、李琛（2017）的方法等进行。

1. 2. 6 LC-MS/MS及数据分析方法 DDA数据采用Maxquant（Maxquant_1.5.3.17）进行数据库检索，采用Tobacoo_uniprot下载数据库，并将iRT肽段序列添加到数据库中。参数设置参照邵若玄等（2018）、傅龙龙（2019）的方法进行。数据库检索鉴定到的蛋白必须通过设定的过滤参数，即错误发现率（FDR）<1%。将原始RAW文件和搜库结果导入Spectronaut软件构建质谱数据库，并采用Spectronaut Pulsar X_12.0.20491.4进行DIA数据处理，数据库与建库所用数据库相同。参数设置如下：retention time prediction type设为dynamic iRT;interference on MS2 level correction设为enabled;cross run normalization设为enabled，所有结果必须通过设定的过滤参数Q value cutoff为0.01（相当于FDR<1%）。

2 结果与分析

2. 1 样品总蛋白提取质量检测结果

提取高质量的植物样品蛋白质是后续构建数据库及准确鉴定蛋白质的先决条件，要求提取的蛋白质样品损失小，降解率低，非蛋白杂质少，溶解度高，释放尽可能多的肽段。本研究采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖全蛋白，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示。样品中含有分子量在25～66.2 kD之间的高丰度蛋白，横向条带平行性好，电泳条带清晰，说明样品间一致性较好，提取的蛋白质量满足试验要求。

2. 2 根尖蛋白浓度测定结果

蛋白质浓度的测定可为后期质谱检测中样品上样量的确定提供依据。由根尖样品总蛋白质提取结果（表1）可知，6个供试材料的蛋白质浓度为2.3983～2.8875 μg/μL，20 μg样品的总体积在7.1874～8.8313 μL，差异较小，样品等级均为A级，满足上样量需求。

2. 3 蛋白质图谱数据库构建结果

DIA采用全息扫描模式获得的图谱极其复杂，难以和当前数据库进行直接比对，从而无法完成蛋白质的定性。因此，需对实际样本进行深度DAA分析，以获得实际样本的质谱图库。本研究共检测到28042条肽段，共鉴定得到7084个蛋白质，表明构建的DDA数据库信息资源丰富，对提高后续蛋白质鉴定的准确性和定量数目具有重大意义。

2. 4 质谱数据的质量检测分析结果

要评价某个方法对实验样本的适用性，首先需要对得到的原始数据进行质量控制分析。一般的评价指标有平均数据点、峰容量、肽段的iRT及FDR等。由質谱数据的质控分析可看出，DIA数据的色谱峰平均数据点为7（图2），平均的峰容量达260（图3），主要肽段的iRT均被检测出，并且整体较稳定（图4），在Q值为0.01标准下的一致性得分（Concensus Score，Cscore）为0.948（图5），QC样品（一般为所有样本的混样）变异系数（Coefficient of variation，CV）中值为11.5%（小于20.0%），相关系数大于0.9（图6和图7）。

2. 5 蛋白质的定性检测结果

DIA分析结果（图8）显示，6个供试材料的蛋白质数量存在差异。Va116×Basma、Va116和Basma中鉴定到的蛋白质数量较多，达到5069和5064个;K326和青梗的蛋白质数量最少，分别为4638和4149个;2个杂交种材料的蛋白质数量居中，分别为4946和4721个。可见，DIA全息扫描模式下鉴定的蛋白质范围广、数量大、可信度高，供试材料的蛋白质较丰富。

3 讨论

3. 1 根尖蛋白质样品的提取方法

由于烟草根系组织中含有大量的色素、氧化酶、糖、酯类、多酚类及其他次生代谢物质，使得蛋白质的提取较为困难，因此，在进行蛋白质提取时要尽可能地去除样品中的杂质成分（李浩，2007;王润润等，2019）。林世峰等（2012）以烟草K326的生长期根系为材料，通过比较4种蛋白质提取方法，结果表明酚提取法更适合于幼嫩根系的蛋白质提取，TCA/丙酮沉淀法易使样品降解，且高分子量的蛋白易丢失。在黄瓜根系研究中TCA/丙酮沉淀法能获得较好的凝胶图谱（王珊珊等，2012），但在棉花根系相关研究中，此法并不是最佳方法（王曼等，2015）。可见，不同作物因其自身特性，所适用的蛋白质提取方法也不同。本研究使用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖全蛋白，得到分子量介于25～66.2 kD的高丰度蛋白，且样品蛋白电泳条带清晰。可见，核酸和脂蛋白的影响小，杂质少，表明TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法适用于烟草根尖组织的蛋白质提取。

3. 2 蛋白质的定性分析

对复杂混合物中的蛋白质进行定性是蛋白质组学研究的一个重要目标，蛋白质定性的准确性对后期生物标志物的筛选具有重要意义。采用传统的DDA方法，唐秀英等（2019）通过比较常温与低温处理下水稻苗期根系蛋白质组，共获得可信肽段数12673条，鉴定的蛋白数量为3346个;高文霞等（2021）对青枯菌接种3 h的D101烟苗根系进行蛋白组分析，共鉴定到6762个蛋白质。本研究应用DIA蛋白质组学方法，首先对所有样本的混合进行样品酶解和HPRP分级，经过DDA分析，使用MaxQuant进行数据库检索鉴定，利用Spectronaut pulsar X软件构建图谱库，建立了DIA 数据库，其中包含28042条肽段，鉴定出7084个蛋白质，在不同比较组中筛选到大量差异表达蛋白。可见，采用DIA LC-MS方法构建的质谱数据库信息资源丰富，对提高后续蛋白质鉴定的准确性和定量数目具有重要意义，得到的差异表达蛋白可为生物性状标记物的筛选提供相关参考依据。

4 结论

DIA LC-MS分析鉴定的蛋白质范围广、数量大、可信度高，具有一定的可靠性和稳定性，各项质控指标均能达到试验分析要求，说明DIA LC-MS适用于烟草根尖蛋白质组样品的检测分析。

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收稿日期：2021-01-08

基金项目：国家自然科学基金项目（32060510）;贵州省科技厅项目（〔2016〕5663）;贵州省科技厅项目（〔2019〕1405）

通讯作者：刘仁祥（1971-），https：//orcid.org/0000-0003-4562-8507，教授，主要从事烟草遗传育种研究工作，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn

第一作者：莫泽君（1994-），https：//orcid.org/0000-0002-4251-9922，研究方向为作物遗传育种，E-mail：mojun11@foxmail.com