蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化

李广伟，杨春晓，于 杰，刘 盛，张卓睿*

（1.山东潍坊科技学院经济管理学院，山东 潍坊 261000；2.北华大学林学院，吉林 吉林 132013）

蓝莓（Semen trigonellae）是杜鹃花科越橘属植物[1]，属多年生灌木小浆果果树，其果实营养价值较高，富含维生素A（vitamin A，VA）[2]、维生素E（vitamin E，VE）[3]、花青素[4]、酚酸[3]、熊果酸[3]、类黄酮[3]和超氧化物歧化酶[5]等天然活性成分，具有改善视力[6]、抗氧化[7]、增强免疫力[8]、抑菌[9]和保护心脑血管[10-11]等功效，是联合国粮食及农业组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）推荐的五大营养健康水果之一，被誉为“浆果之王”[2-4]。酸樱桃（Cerasus valgarisMill.）是蔷薇科李属经济树木[12]，其果实为核果，含有多糖、维生素和矿物质等营养物质，尤其是原花青素[13]、花色苷[14]、褪黑激素[15]、槲皮素[12]等功效成分含量较高，具有清除自由基[14]、抗癌[12]、改善睡眠[16]、降低血糖[17]等药理作用。

果酒是将破碎、压榨后的水果经发酵等工艺制成的一类饮料酒，酒精度低，一般为7%vol～18%vol[18-19]。果酒中富含氨基酸、维生素、多糖、多酚等多种活性成分，营养价值较高，可起到控制人体内胆固醇和促进血液循环、预防心脑血管疾病，调节新陈代谢，抗衰老等功效[20]。近几年，果酒需求量逐年增大，研制果酒新品种成为食品研究领域的新热点[21]。

目前已有利用蓝莓酿制果酒的相关报道。刘彩婷[22]通过对比18种商业酵母的发酵过程，筛选出了最适宜蓝莓酒的JK10酵母，并确定了蓝莓酒的最佳发酵工艺条件。胡佳星等[23]对野生蓝莓果酒的发酵工艺进行了优化，并采用最佳发酵工艺条件制备果酒的酒精度为4.2%vol，感官评分为87分。李安等[24]研究了发酵及贮藏条件对蓝莓果酒中花色苷的影响。关于樱桃果酒方面的研究也较多。李志友等[25]对樱桃果酒的酿造工艺进行了优化，采用最佳的工艺条件所得樱桃果酒口味醇正，酒精度为10%vol～11%vol。雷丹等[26]通过试验研究，制得了酒精度为10.8%vol、口感较好的川西高原野樱桃果酒。张秀艳等[27]改良了酿造工艺，使得樱桃果酒的理化指标和感官指标有了较大提高。彭璐等[28]筛选出的产香酵母，能使樱桃酒增加20种香气成分。

基于蓝莓和酸樱桃的营养特色，本研究以蓝莓、酸樱桃为原料制备蓝莓-酸樱桃复合果酒，以初始糖度、发酵温度和发酵时间为自变量，以酒精度为响应值，通过单因素试验和响应面试验优化蓝莓-酸樱桃复合果酒的发酵工艺条件，以期丰富果酒的产品种类，增加两种水果的应用途径，提高食用附加值，克服其供应季短、不耐运输和贮藏的局限性，为推进两种水果的种植业发展和产业化进程提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

酸樱桃：采于吉林省蛟河试验林场，预冷（-20 ℃预冷24 h）后放入冰箱内冷冻（-80 ℃）贮藏；蓝莓：采于吉林省临江蓝莓基地，预冷（-20 ℃预冷24 h）后放入冰箱内冷冻（-80 ℃）贮藏。

1.1.2 试剂

安琪果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（优级纯）：市售；亚硫酸氢钠、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

SPX-2500S-Ⅱ型生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：江苏省金坛市科技仪器有限公司；LDZX-40 Ⅱ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；FA2004A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；精密酒精计：河间市振岩仪器仪表厂。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓-酸樱桃复合果酒工艺流程及操作要点

操作要点：

蓝莓、酸樱桃的预处理：去除蓝莓果和酸樱桃果中的杂质，以及一些有病虫害和霉烂的坏果，将挑选出来的果实冲洗干净，沥去水分，酸樱桃去核。

混合、破碎：将蓝莓与去核后的酸樱桃按配比1∶1（g∶g）混合，充分破碎、搅拌，使两种果浆能均匀的混合在一起。

成分调整、灭菌：按照试验所确定的添加量，向混合果浆中加入23%蔗糖，同时，为了起到杀菌作用，按混合果浆总量的0.04%加入NaHSO3，在60～65 ℃条件下巴氏杀菌25～30 min。

酵母活化：将安琪果酒酵母按料液比1∶10（g∶mL）加入到2%蔗糖溶液中，在35 ℃条件下活化30 min[29]。

发酵：将活化好的果酒酵母按0.06%接种量接种到灭菌后的蓝莓、酸樱桃复合果浆中，搅拌均匀后，在22 ℃条件下发酵13 d，每隔24 h检测一次发酵液的初始糖度，当初始糖度降至6%以下时，停止发酵。

酒渣分离和后发酵：将发酵好的蓝莓-酸樱桃酒液用滤布过滤，过滤出的酒液在18 ℃条件下后发酵20 d，然后倒罐、分离酒脚。

陈酿、成品：在17～18 ℃条件下陈酿70～80 d，期间进行倒罐、下脚澄清等处理，陈酿后的酒液用300目滤布过滤，即得蓝莓-酸樱桃复合果酒成品。

1.3.2 蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化单因素试验

采用单因素轮换法，以酒精度和感官得分为评价指标，分别考察蓝莓与酸樱桃的质量比（4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4（g∶g））、初始初始糖度（17%、19%、21%、23%、25%）、酵母接种量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、发酵温度（18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃）、发酵时间（7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）对蓝莓-酸樱桃复合果酒的影响。

1.3.3 蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，以发酵时间（A）、发酵温度（B）和初始糖度（C）为试验因素，以酒精度（Y）为响应值，进行3因素3水平的响应面试验设计，因素与水平见表1。

表1 蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of blueberry-sour cherry compound fruit wine

1.3.4 分析检测

酒精度、总糖、总酸的测定采用国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法、直接滴定法及电位滴定法[30]；糖度的测定采用折光计法[31]。

1.3.5 感官评价

参照国标GB/T 32783—2016《蓝莓酒》中感官评分要求[32]，结合蓝莓-酸樱桃复合果酒的特点，请10位专业人员从色泽、气味、口感和状态四个方面对复合果酒进行感官评价，满分为100分，感官评分标准见表2。

表2 蓝莓-酸樱桃复合果酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of blueberry-sour cherry compound fruit wine

续表

1.3.6 数据处理

使用Excel 2010对单因素试验结果进行数据分析和处理，所有数据均平行测定3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。响应面试验结果采用Design-Expert 8.0.6软件进行数据处理，所有数据均平行测定3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 蓝莓与酸樱桃最佳配比的确定

由表3可知，在蓝莓和酸樱桃质量比为4∶1～1∶4的范围内，各样品的酒精度在（9.1±0.14）%vol～（9.7±0.12）%vol之间，相差不大，说明蓝莓和酸樱桃不同配比对复合果酒的酒精度有一定的影响，但影响效果不显著。当蓝莓和酸樱桃质量比在4∶1～1∶2时，酒精度呈增加趋势，由于酿酒酵母适宜在pH 4左右的酸性环境中生长繁殖，而酸樱桃中有机酸含量较高，所以随着其添加量的增加，复合果酒的酒精度逐渐增大；当蓝莓：酸樱桃的质量比为1∶2时，酒精度达到最大值，为（9.7±0.12）%vol；之后再继续增加酸樱桃的添加量，酒精度降低至（9.5±0.13）%vol，究其原因可能是，加入过量的酸樱桃会使复合果酒酸度低于适宜的范围，不利于酵母发酵。通过感官评价，发现两种水果的不同质量比，对复合果酒的口感影响较大，当蓝莓酸樱桃质量比超过1∶1时，复合果酒过酸，品尝起来有明显的刺口、尖锐感，口感变差。因此，综合考虑复合果酒的酒精度和感官评价，确定蓝莓和酸樱桃的适宜质量比为1∶1，此时复合果酒的酒精度为（9.6±0.10）%vol，感官评分为（79.8±0.17）分。

表3 蓝莓和酸樱桃质量比对复合果酒品质的影响Table 3 Effect of mass ratio of blueberry and sour cherry on compound fruit wine quality

2.1.2 初始糖度的确定

由表4可知，随着复合果汁中初始糖度在17%～23%范围内的增加，复合果酒的酒精度逐渐增大，当初始糖度为23%时，酒精度达到最大值，为（10.6±0.12）%vol，此时复合果酒酸甜适口，具有明显的果香和酒香，香气协调，感官品质最好，感官评分为（78.1±0.21）分；之后初始糖度增加至25%时，酒精度有所下降。这是因为渗透压增高而抑制了酵母的活性，导致发酵出现延滞，而且，由于发酵后的酒液中残余糖分过高，复合果酒的口感偏甜，感官品质下降，评分降至（74.2±0.16）分。因此，确定蓝莓-酸樱桃复合果酒的适宜初始糖度为23%。

表4 初始糖度对复合果酒品质的影响Table 4 Effect of initial sugar content on compound fruit wine quality

2.1.3 酵母接种量的确定

由表5可知，随着复合果酒酵母添加量在0.04%～0.06%范围内的增加，酒精度急剧增大，这是因为果汁中糖分能充分转化为酒精，当复合果酒酵母添加量为0.06%时，酒精度达到最大值（10.7±0.31）%vol，此时所得复合果酒呈宝石红色，酸甜适口，果香和酒香协调，感官评分最高为（77.8±0.21）分，之后再继续增加果酒酵母添加量至0.12%，酒精度出现下降趋势。这是因为较多的糖分用于了微生物的生长繁殖，且易导致酵母细胞的过早老化、自溶等[33]，不利于发酵。由感官评分可知，酵母添加量过高，会使蓝莓-酸樱桃复合果酒的口感偏酸涩，甚至会产生苦味，感官评分逐渐降低。因此，确定蓝莓-酸樱桃复合果酒适宜酵母接种量为0.06%。

表5 酵母接种量对复合果酒品质的影响Table 5 Effect of yeast inoculum on compound fruit wine quality

2.1.4 发酵温度的确定

环境温度过低或过高都会影响果酒酵母的酶活性。由表6可知，随着发酵温度在18～24 ℃范围内的增加，酒精度呈上升趋势；在发酵温度为24 ℃时，复合果酒的酒精度和感官评分最高，分别为（11.8±0.21）%vol、（78.5±0.42）分，果酒呈宝石红色，果味和酒香协调，口感清爽，后味甘甜；当发酵温度高于24 ℃时，酒精度有所下降。通过对各试验组的感官评价发现，蓝莓-酸樱桃复合果酒的发酵温度不适宜超过24 ℃，否则酒体会产生苦涩味，颜色变淡，同时果香也逐渐不明显，感官品质下降。因此，确定蓝莓-酸樱桃复合果酒的适宜发酵温度为24 ℃。

表6 发酵温度对复合果酒品质的影响Table 6 Effect of fermentation temperature on compound fruit wine quality

2.1.5 发酵时间的确定

由表7可知，在蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵过程中，发酵时间7～13 d是酿酒酵母生成酒精的旺盛时期，当发酵时间为13 d时，蓝莓-酸樱桃复合果酒的酒精度为（13.1±0.33）%vol，其香气和谐，酒味醇厚，风味较好，感官评分为（81.4±0.27）分，继续延长发酵天数至15 d，酒精度和感官评分略有下降。为了提高生产效率，确定蓝莓-酸樱桃复合果酒的适宜发酵时间为13 d。

表7 发酵时间对复合果酒品质的影响Table 7 Effect of fermentation time on compound fruit wine quality

2.2 蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）和初始糖度（C）为自变量，以酒精度（Y）为响应值，采用响应面法优化蓝莓-酸樱桃复合果酒的最佳发酵工艺条件，响应面试验设计及结果见表8，方差分析结果见表9。

表8 蓝莓-酸樱桃复合果酒发酵工艺优化响应面试验设计及结果Table 8 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of blueberry-sour cherry compound fruit wine

表9 回归模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6软件对结果进行回归拟合，得到蓝莓-酸樱桃复合果酒的酒精度（Y）对发酵时间（A）、发酵温度（B）和初始糖度（C）的二次多项回归方程为：

由表9可知，所得回归模型差异极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.586 0＞0.05），说明该模型拟合度良好，回归方程具有统计学意义，用此方程代替真实点对试验结果进行分析，误差较小；变异系数（coefficient of variation，CV）＝0.68%＜1%，表明各试验结果的精密度高，结果真实可靠[34]；决定系数R2=0.994 5，调整决定系数R2adj=0.987 4，表明方程拟合度高[35]。因此，可利用该模型分析和预测蓝莓-酸樱桃复合果酒的发酵工艺条件。

2.2.2 响应面交互作用分析

发酵温度（B）、发酵时间（A）、初始糖度（C）交互作用对酒精度影响的响应面及等高线见图1。

图1 各因素交互作用对酒精度影响的响应面及等高线Fig. 1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content

根据各因素间的三维响应面图和等高线图判定各因素间交互作用的强弱，反映两因素间的交互作用对响应值的影响大小。响应面图曲面坡度幅度代表响应值的变化幅度，曲面坡度越陡，对响应值的影响越大，反之，则越小。由图1可知，各因素交互作用的响应面曲线都出现了极大值，说明3个试验因素所选择的水平范围合理，能反映出对酒精度的影响趋势。结合方差分析可知，发酵时间与发酵温度交互作用极显著（P=0.001 1＜0.01），发酵温度与初始糖度交互作用极显著（P=0.009 1＜0.01），两种交互作用的响应曲面都比较陡峭，对复合果酒酒精度具有极显著的影响；发酵时间与初始糖度交互作用显著（P=0.0490＜0.05），说明该交互作用虽然对酒精度有影响，但影响程度要低于前面两种交互作用。

2.2.3 响应面模型验证试验

通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出蓝莓-酸樱桃复合果酒的最佳发酵工艺条件为发酵时间12.62 d，发酵温度22.22 ℃，初始糖度22.67%，软件预测的酒精度值为13.3%vol，为方便实际操作，将优化条件修正为发酵时间13 d，发酵温度22 ℃，初始糖度23%，按照修正后的发酵工艺条件进行3次平行验证试验，实际测得蓝莓-酸樱桃复合果酒的酒精度实际平均值为（13.4±0.11）%vol，实际值与预测值相差不大，表明该工艺可行。

2.2.4 蓝莓-酸樱桃复合果酒理化指标测定结果

通过此工艺参数所得蓝莓-酸樱桃复合果酒酒体澄清透明，口感香醇，酒精度为（13.4±0.11）%vol，总糖（以葡萄糖计）含量为3.7 g/L，总酸（以乙酸计）含量为6.5 g/L，符合国标GB/T 32783—2016《蓝莓酒》要求。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过响应面试验优化得到蓝莓-酸樱桃复合果酒的发酵工艺条件为蓝莓和酸樱桃的质量比1∶1，酵母接种量0.06%，初始糖度23%，发酵时间13 d，发酵温度22 ℃，在此优化条件下，所得果酒酒精度实际值为（13.4±0.11）%vol，酒体呈宝石红色，澄清透明，口感醇厚，总糖（以葡萄糖计）含量为3.7 g/L，总酸（以乙酸计）含量为6.5 g/L，符合国标GB/T 32783—2016《蓝莓酒》要求。