17种市售广式酱油中风味物质的检测分析

陈 杰，赵 莹，韩舜羽，白卫东*，刘晓艳

（1.广东粤师傅调味食品有限公司，广东 开平 529300；2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225）

酱油的香气是决定其产品质量的重要因素之一，虽然在酱油组分中的含量甚微，但其成分极为复杂，对酱油的风味有极大的影响，是体现酱油风味特征的重要元素之一[1]。根据酱油中挥发性风味物质的化合物结构特点，一般将其分为酯类、醇类、酚类、吡嗪类、酮类、酸类、呋喃类、含硫类与其他含氮类化合物。酱油的香气物质容易挥发，香气的优劣就成为了人们对其风味的第一印象。因此，对酱油中挥发性风味物质的剖析尤为重要。酱油中的呈味物质按化合物种类分，主要有有机酸、游离氨基酸、核苷酸、小分子肽、有机碱及糖醇等。除了挥发性风味物质，氨基酸与有机酸也是评价酱油品质的重要指标，酱油中酸味的重要成分是主要是有机酸。具有多种味道的游离氨基酸决定了食品味道鲜美的程度，不仅是酱油典型风味的重要组成部分也是决定酱油类型的主要依据之一[2]。为探究市售广式酱油的风味区别及鉴定出重要的风味物质，本文对17种不同品牌，不同等级的市售酱油进行挥发性风味物质、氨基酸与有机酸的检测，对各风味物质进行定性定量，并通过香气活性值或滋味活度值筛选出酱油中起重要贡献的物质。以期对广式酱油的风味及未来发展正提供一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

17个酱油样品（分别编号为A（特级）、A1（一级）、A3（三级）、B（特级）、C（特级）、D（特级）、E（特级）、F（特级）、G（特级）、G1（一级）、G2（二级）、G3（三级）、H（特级）、I（特级）、I1（一级）、I2（二级）、I3（三级），字母相同为同一品牌）：均产自广东省。

二甲基-三庚酮：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；氨基酸标品：美国Sigma公司；缓冲液B1、B2、B3、B4、B5、B6（均为色谱纯）：日本日立公司；磷酸二氢钾、磷酸、硫酸锌（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；亚铁氰化钾（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；甲醇（色谱纯）：麦瑞达公司；L-焦谷氨酸（纯度＞98%）：上海麦克林生化科技有限公司；乙酸、L-酒石酸、无水柠檬酸、L-苹果酸、L-乳酸、琥珀酸、草酸（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

6890-5973型气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS），DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25mm×0.25 μm）、1260型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、ZORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美国Agilent科技有限公司；85-2型数显控温磁力搅拌器：常州市金坛大地自动化仪器厂；57330-U型固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手动进样手柄：美国Supelco公司；100 μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）型萃取纤维：美国Supelco公司；5810R型多功能台式离心机：德国艾本德公司；KQ5200V型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Hitachi L-8900型全自动氨基酸分析仪：日立高新技术公司。

1.3 实验方法

1.3.1 挥发性风味物质的检测方法

样品前处理：取一颗Φ8 cm的转子放入干燥好的固相微萃取瓶，加入20 μL质量浓度166 mg/L的二甲基三庚酮甲醇及8 mL酱油，放入水浴60 ℃条件下平衡10 min，使用100 μm PDMS萃取针在转速1 100 r/min、60 ℃条件下萃取45 min，解吸5 min，萃取头首次使用时，在规定温度条件下老化至无杂峰，两个样品间烧针10 min。

GC-MS条件：DB-WAXUI毛细柱色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm）。进样口温度230 ℃，不分流模式。载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min。升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持0 min，再以3 ℃/min升至220 ℃，保持7 min，后运行5 min。离子源为电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV；连接口温度250 ℃；质量扫描范围33～330 amu。

定性定量方法：在美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）02.L质谱数据库检索和标准谱图比较对未知化合物进行检索，并利用内标（二甲基三庚酮-甲醇）的浓度与检测出的各物质峰面积计算物质的含量。

1.3.2 氨基酸的检测方法

样品前处理：称取1 g酱油样品，加1 mL体积分数15%的磺基水杨酸沉淀蛋白，用水定容至25 mL容量瓶中，取部分置于离心管中，10 000 r/min离心10 min，再取上清液1 mL稀释至25 mL容量瓶，加水定容，取一定量压滤进样。

标准溶液的配制及标准曲线的绘制：用标准样品配制一系列不同浓度的标准液，压滤氨基酸分析仪测试，以氨基酸质量浓度为横坐标，各氨基酸峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

色谱检测条件：色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱（4.6 mm×250 mm）；流速：0.4 mL/min（pump1），0.35 mL/min（pump2）；检测波长：570 nm、440 nm；柱温：57 ℃；进样体积：20 μL；流动相按表1进行梯度洗脱，反应温度：135 ℃，分析时间35 min。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient eluting program

1.3.3 有机酸的检测方法

标准溶液的配制及标准曲线的绘制：分别准确称取草酸8.3 mg，酒石酸39.4 mg，苹果酸88 mg，乳酸56.8 mg，乙酸143.5 mg，柠檬酸60.6 mg，焦谷氨酸14.4 mg，丁二酸106 mg，混合定容至25 mL，混合均匀，取标准溶液分别稀释成20 μL/mL、100 μL/mL、200 μL/mL、400 μL/mL、600 μL/mL、800 μL/mL与原始标准溶液浓度1 000 μL/mL，7个浓度梯度，进样10 μL，采用外标法进行定量处理，以有机酸含量为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

样品前处理[4]：精密吸取1 mL样品于50 mL离心管中，用水定容至10 mL，加入2 mL 10.6%亚铁氰化钾溶液混匀后，再加入2 mL 30%硫酸锌溶液，加水定容至40 mL后静置30 min以上，6 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm水系滤膜，取过滤液上样。

HPLC色谱条件[5]：色谱柱ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm×5 μm），流动相A为甲醇，流动相B为0.01 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸调pH到2.83），两者比例为3∶97，流速0.8 mL/min；柱温30 ℃，紫外检测波长214 nm，进样量10 μL。

1.3.4 香气活力值、滋味活度值计算

香气活性值（odor activity value，OAV）是评价香气化合物重要性的一个指标，OAV＞1则对样品香气组成有贡献，OAV越大，该香气化合物贡献越大，其计算公式如下：

滋味活度值（taste active value，TAV）与OAV一样，都是浓度与阈值之比得到的数据，是用来评价风味物质贡献度的一个指标，当TAV＞1时，表明该滋味物质对样品滋味有显著影响，且数值越大，贡献作用越大；当TAV＜1时，表明该滋味物质对整体滋味贡献不显著，其计算公式如下：

1.3.5 数据处理

采用Origin 8.5和Excel 2018对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 17种市售广式酱油中挥发性风味物质含量分析

2.1.1 17种市售广式酱油中各类挥发性风味物质的占比分析运用GC-MS对17种市售广式酱油的挥发性风味物质进行检测，结果见图1。

图1 17种市售广式酱油中挥发性风味物质含量比例Fig. 1 Content proportion of volatile flavor substances in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

由图1可知，17种市售广式酱油中共检测出245种挥发性风味物质，总含量为2 894.9～16 492.3 μg/kg。包括酸类11种（971.47～5 760.54 μg/kg）、醛类21种（67.54～260.54 μg/kg）、酚类26种（197.62～143.75 μg/kg）、吡嗪类22种（147.93～379.34 μg/kg）、酮类43种（672.19～1 542.97 μg/kg）、酯类51种（220.09～560.42 μg/kg）、醇类32种（452.63～6 967.54 μg/kg）、含硫化合物8种（17.54～62.49 μg/kg）、呋喃类9种（33.64～104.37μg/kg）和其他含氮类化合物（除了吡嗪）22种（114.25～742.63 μg/kg）。主体挥发性风味成分由酸类、醇类、酯类及酚类组成。

酱油C、A3、G2的酸类物质含量很大（60%、56%、46%），主要的酸类有乙酸和山梨酸，其中乙酸在每种酱油中均有检测到，有些酱油山梨酸过多，可能原因是山梨酸钾添加过多。酱油A、B的醇类物质含量最大（71%、52%），主要的醇类有苯乙醇和乙醇，其中苯乙醇在每种酱油中均检测到，苯乙醇有玫瑰样的香气，先苦后甜的桃子味道，以游离态或酯化结合态存在于某些天然产物中[8]。乙醇含量也很高，但仅在6个样品中检出。酱油E、D中的酯类含量最大（68%、32%），主要的酯类有十六烷酸乙酯、亚油酸乙酯、苯乙酸乙酯等，其中十六烷酸乙酯在每种酱油中均检测到，十六烷酸乙酯与亚油酸乙酯属于高级脂肪酸酸，是豆类等在酿造过程中产生的具有典型果香味的物质，该类物质使酿造酱油的香气更浓郁、协调[9]。酱油D、A1中的酚类含量最大（48%、34%），主要的酚类有乙基愈创木酚、愈创木酚与4-乙基苯酚。酱油酿造过程中，酚类物质主要是通过曲霉的降解作用生成的，具有香气特征明显、活性强的特征，对酱油风味有较大的贡献[7，10]。醛类物质在酱油中含量相对较少，各酱油中醛类相对含量在0～7%，醛类物质主要来自氨基酸降解、微生物的转化作用和油脂的氧化降解，有些醛类物质本身不是呈味成分，但醛类化合物一般可与醇类发生反应生成酱油特有的香气成分[9]。主要的醛类有5-甲基-2-苯基-2-己烯醛（坚果香、可可香、青香）与苯乙醛，这两种物质分别在12种酱油中检测出。吡嗪是一类具有坚果香，焦香味的物质。是酱油中重要的风味物质，其中酱油A的吡嗪最突出，相对含量为12%，其他酱油中的吡嗪类较少，相对含量在0～6%。酱油A1中酮类物质相对含量最大，主要的酮类有巨豆三烯酮与香叶基丙酮，前者在各样品中均有检测到，后者具有新鲜、清淡的花香香气。含硫化合物虽然相对含量不高，占比在0～2%，但对整体风味有很大影响，它们来自含硫氨基酸、肽等的降解，主要检测到的含硫类化合物是3-（甲硫基）-1-丙醇，在5种酱油中检出，低浓度时有强烈芬芳的肉或肉汤香气和滋味。呋喃类化合物及糠醛在微生物作用下会产生一定的化学反应，使反应物产生谷物香气及咖啡香气，主要的呋喃类有3-苯基-呋喃，据文献报道，3-苯基-呋喃具有甜香味[11]。2-乙酰基吡咯是主要检测到的含氮类化合物（除了吡嗪类），每种酱油中均检测到，其具有焦糖香与甜香[11]。

2.1.2 市售酱油中各类挥发性风味活性物质的定量分析

为了进一步明确各种酱油的主体风味成分，采用香气活性值分析了17种市售广式酱油间的主体风味成分构成，结果见表2。

表2 17种市售广式酱油关键香气组分的香气活性值Table 2 Aroma activity values of key aroma components in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

由表2可知，17种市售广式酱油样品中，均被检测到的物质是苯乙醇，苯乙醇（含量69.79～11 079.31 μg/kg）在部分酱油中贡献突出。另外，苯乙醛（含量43.62～92 052.78 μg/kg）、4-乙基愈创木酚（含量71.47～13 086.21 μg/kg）、愈创木酚（含量79.78～11 542.93 μg/kg）与3-苯基-呋喃（含量52.61～10 009.73 μg/kg）虽然不是每种酱油中都有检测到，但OAV都比较高，推测以上5种挥发性风味物质可能是广式酱油中重要的活性物质。赵谋明等[11]使用HS-SPME-GC-MS/O联用分析了酱油中香气活性化合物的结果显示，这5种物质均被检出且风味强度在2.7及以上。乙酸乙酯、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、3-甲基-丁醛、2-异丁基-3-甲基吡嗪在酱油中的OAV也较高，但仅在个别酱油中有检出，说明这些物质的有无是区别不同酱油产生不同风味的原因。

虽然不同酱油的风味存在着一定的差异，且不同酱油间风味化合物的组成及含量各不同，但它们的主体香气成分存在着相互交叉的关联，各种化合物相互作用使各种酱油具有独特的风味。

2.2 市售酱油的氨基酸结果分析

2.2.1 市售酱油中各氨基酸含量的占比分析

运用全自动氨基酸分析仪对17种市售酱油的16种呈味氨基酸进行检测，结果见图2。

由图2可知，17种市售广式酱油中16种呈味氨基酸的总含量为33.5～104.1 mg/g。其中天冬氨酸（Asp）含量为1.14～5.29 mg/g，苏氨酸（Thr）0.98～2.60 mg/g，丝氨酸（Ser）1.36～3.57 mg/g，谷氨酸（Glu）4.85～77.24 mg/g，脯氨酸（Pro）0～2.80 mg/g，甘氨酸（Gly）0.76～2.01 mg/g，丙氨酸（Ala）1.28～5.07 mg/g，缬氨酸（Val）1.58～4.21 mg/g，蛋氨酸（Met）0～0.91 mg/g，异亮氨酸（Ile）1.28～3.54 mg/g，亮氨酸（Leu）1.82～5.29 mg/g，酪氨酸（Tyr）0.18～1.16 mg/g，苯丙氨酸（Phe）1.19～4.25 mg/g，赖氨酸（Lys）1.46～3.74 mg/g，组氨酸（His）0.16～0.94 mg/g，精氨酸（Arg）0.13～3.47 mg/g。

图2 17种市售广式酱油中氨基酸含量比例Fig. 2 Content proportion of amino acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

所有酱油样品中，谷氨酸的含量普遍较高，其次是亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等，而组氨酸、酪氨酸和蛋氨酸的含量较低，脯氨酸仅在3种酱油中检测到。

通过比较可以发现，不同酱油中氨基酸的组成和含量均存在较大差异。如酱油中谷氨酸含量占氨基酸总量最高的达79%，最低的只有11%。据文献报道，酿造酱油中的谷氨酸占总氨基酸的比例一般在18%～25%左右，如果超过该比例，则认为可能是添加了谷氨酸钠作为增鲜剂[16]。不同品牌间，氨基酸的组成和含量存在较大差异，可能与各公司原料及工艺不同有关。

2.2.2 市售酱油中各氨基酸的滋味活度值

由表3可知，谷氨酸的TAV贡献范围为16.18～257.5，对酱油风味贡献值最大且远高于其他氨基酸，谷氨酸本身呈酸味，但以钠盐形式存在时具有很强的鲜味[17，24]；其次贡献值较大的氨基酸有缬氨酸、丙氨酸与赖氨酸；而苏氨酸、酪氨酸、甘氨酸与脯氨酸TAV普遍＜1，说明它们对酱油滋味贡献程度较小。精氨酸的贡献呈现两极分化，在特级酱油中贡献值较大，而非特级酱油的精氨酸贡献值普遍很低。

表3 17种市售广式酱油的氨基酸滋味活度值Table 3 Taste active values of amino acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

2.3 市售酱油的有机酸结果分析

2.3.1 市售酱油中各有机酸含量的占比分析

运用高效液相色谱仪对17种市售酱油的8种有机酸进行检测，结果见图3。

图3 17种市售广式酱油中有机酸含量比例Fig. 3 Content proportion of organic acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

由图3可知，17种市售酱油中8种有机酸的总含量为42.1～323.5 mg/mL。其中草酸含0.71～2.31 mg/mL，酒石酸0.19～2.34 mg/mL，苹果酸0～0.95 mg/mL，乳酸0.37～15.74 mg/mL，乙酸1.13～5.86 mg/mL，柠檬酸7.29～173.24 mg/mL，焦谷氨酸1.90～7.68 mg/mL，丁二酸23.78～193.16 mg/mL。

所有酱油样品中，丁二酸与柠檬酸的含量占比最高，乳酸其次，乙酸、焦谷氨酸占比较少，草酸与酒石酸的含量最少。仅A、G2酱油含苹果酸。其中，丁二酸呈酸鲜味，柠檬酸呈温和爽快酸味，乳酸呈爽口酸略带涩味，焦谷氨酸不呈味，乙酸与酒石酸呈刺激性酸味，苹果酸呈爽快酸略带苦味[18，22]，这些有机酸在酸味及风味方面对酱油的风味起到了一定的综合作用。虽然焦谷氨酸在谷氨酰胺浓度较低时，可由谷氨酸转化而成，但是焦谷氨酸并不呈鲜味[19，21]。据有关研究报道，酱油中的乙酸与乳酸占比较高[4，14]，也有研究显示酱油的乳酸与焦谷氨酸占比较高[20，25]，而本试验的结果是丁二酸或柠檬酸最高，具体原因有待进一步研究。

2.3.2 市售酱油中各有机酸的滋味活度值

由表4可知，丁二酸本身含量最大，由于阈值很小，呈味贡献很突出。滋味活度值范围为224.31～1 822.29，其次是柠檬酸范围为16.20～384.98，酒石酸的活度值范围为12.89～155.82，乙酸、乳酸与苹果酸的活度值较低，范围分别为9.42～48.84、0.29～12.49与0.48～1.91。丁二酸与柠檬酸两种含量较高的有机酸在特级与非特级酱油之间有明显差异，非特级的滋味活度值较低，而酒石酸、乳酸与乙酸的特级与非特级酱油之间无明显差异。

表4 17种市售广式酱油的有机酸滋味活度值Table 4 Taste active values of organic acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

3 结论

通过对17种市售广式酱油的挥发性风味物质、氨基酸与有机酸进行了检测、分析。结果表明，苯乙醇（69.79～11 079.31 μg/kg）、苯乙醛（43.62～92 052.78 μg/kg）、4-乙基愈创木酚（71.47～13 086.21 μg/kg）、愈创木酚（79.78～11 542.93 μg/kg）与3-苯基-呋喃（52.61～10 009.73 μg/kg）对广式酱油香气活性值（OAV）贡献较大；谷氨酸（4.85～77.24 mg/g）对酱油滋味活度值（TAV）贡献最大且远高于其他氨基酸，其次是缬氨酸（1.58～4.21 mg/g）、丙氨酸（1.28～5.07 mg/g）与赖氨酸（1.46～3.74 mg/g）等；滋味活度值（TAV）贡献最大的有机酸是丁二酸（23.78～193.16 mg/mL），其次是柠檬酸（7.29～173.24 mg/mL）。