星形假丝酵母在强化赤霞珠葡萄酒玫瑰香气中的应用

刘文翰，王 斌，姬茹婕，史学伟，程卫东*

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

传统葡萄酒的酿造方式主要包括自然发酵和商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）纯种发酵，自然发酵依靠葡萄表皮丰富多样的微生物进行发酵，风味复杂，但发酵过程不容易控制，受环境因素影响较大[1]。因此，葡萄酒企业主要采用商业酿酒酵母进行纯种发酵。商业酿酒酵母对酒精、SO2、温度具有较强的耐受性，使用商业酿酒酵母进行纯种发酵可以保证葡萄酒发酵的顺利进行，但容易导致葡萄酒风味同质化[2]。葡萄酒香气是评价葡萄酒质量的重要感官指标之一，分为品种香气、发酵香气和陈酿香气[3]。品种香气来源于葡萄果实中的挥发性香气物质，受葡萄种植环境影响，具有一定地域特色；发酵香气来源于发酵过程中（酿酒酵母和非酿酒酵母）和其他微生物的代谢[4]。葡萄酒发酵过程中，酿酒酵母将酿酒葡萄中的糖转化为酒精，形成葡萄酒的主体，而非酿酒酵母对葡萄酒风味具有重要调节作用[5]。不同的酵母菌株在发酵过程中会产生不同的挥发性香气物质，包括高级醇、酯类、脂肪酸类及萜类化合物等，这些物质对葡萄酒的风味及感官特性有重要的影响[6]。

非酿酒酵母是除酿酒酵母外多种酵母类群的统称[7]。非酿酒酵母最早是从腐败的葡萄酒中分离得到的，被看作是葡萄酒发酵中的有害微生物，且会对葡萄酒的品质带来负面影响[8]。然而，近些年的研究表明，由于非酿酒酵母的独特代谢活动，非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵的葡萄酒中香气物质含量显著高于酿酒酵母纯种发酵[9]。非酿酒酵母可以产生大量的酯类、高级醇，以及其他挥发性化合物，有利于提升葡萄酒的香气、风味等感官特征，但也可能在发酵过程中产生不良的气味对葡萄酒的感官品质带来负面影响[10]。葡萄酒企业迫切需要找到新的酿造方式来改善葡萄酒的感官品质。有研究表明，利用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵对葡萄酒的感官品质有积极的影响[11]。过高的酒精度对葡萄酒的口感及风味存在负面影响，并且可能存在健康安全隐患[12]。星形假丝酵母具有相对较低的酒精转化率，利用星形假丝酵母和美极梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵可以降低葡萄酒中的乙醇含量[13]。有机酸是葡萄酒中重要的风味物质，主要来源于葡萄果实和酵母代谢[14]。星形假丝酵母单菌发酵或与酿酒酵母混合发酵能提高葡萄酒中琥珀酸的含量，对酸度不足的葡萄酒产生积极影响[15]。

挥发性风味物质是葡萄酒品质重要组成部分。苯乙醇是一种具有玫瑰香气的挥发性化合物。本研究以星形假丝酵母（Candida astrulatum）X11和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC01单菌发酵、共同发酵和顺序发酵制备赤霞珠葡萄酒，通过探讨不同发酵方式对赤霞珠葡萄酒中玫瑰香气的影响，避免赤霞珠葡萄酒风味的单一化。采用顶空固相微萃取结合气相色谱与质谱联用（headspace solid-phase microextractions gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技术检测赤霞珠葡萄酒中挥发性香气成分，并对结果进行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）及聚类分析（cluster analysis，CA）。考察星形假丝酵母X11对赤霞珠葡萄酒风味的影响，研究星形假丝酵母X11与酿酒酵母CEC01混菌发酵高品质葡萄酒的条件，为赤霞珠葡萄酒风味改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠葡萄（初始糖度253.14 g/L，pH值为3.85，总酸（以酒石酸计）3.8 g/L）：新疆张裕酒庄；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC01：安琪酵母股份有限公司；星形假丝酵母（Candida astrulatum）X11：石河子大学食品学院葡萄与葡萄酒研究中心分离、筛选及保藏。

偏重亚硫酸钾（分析纯）：上海研生生化试剂有限公司。酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone glucose，YPD）琼脂培养基：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，琼脂2%。121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

8890-5977B型气质联用仪：美国Agilent公司；PDMS/DVB/CAR萃取头：美国Supelco公司；HWJB-2100AT恒温磁力搅拌器：郑州碳邦仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

酿酒酵母CEC01活化：一定量的蔗糖溶解在的蒸馏水中，完全溶解后，加入一定量酿酒酵母，活化20～30 min后，加入5倍酵母液的赤霞珠葡萄汁，培养2 h。

星形假丝酵母X11活化：将星形假丝酵母X11用接种环取2～3环接种于灭菌赤霞珠葡萄汁中（27 ℃、120 r/min）培养12 h；按体积比为1∶100将星形假丝酵母X11培养物接种于经处理的赤霞珠葡萄醪中（27 ℃、120 r/min）培养12 h。

1.3.2 赤霞珠葡萄酒酿酒工艺

新鲜赤霞珠葡萄经过破碎后加入60 mg/L的SO2（偏重亚硫酸钾0.12 g/L），混合完全以避免氧化，随后在10 ℃下冷浸渍24 h。将葡萄醪分成8个不同的接种处理（一式三份）：星形假丝酵母X11单菌发酵（接种量为约1×106CFU/mL）（编号为KF）、酿酒酵母CEC01单菌发酵（接种量约为1×106CFU/mL）（编号为NF）、酿酒酵母CEC01和星形假丝酵母X11共同接种（接种量为1×106CFU/mL，接种体积比为1∶1、1∶5和1∶10）（编号为G1：1、G1：5和G1：10）、星形假丝酵母X11和酿酒酵母CEC01顺序接种（接种量为1×106CFU/mL，接种星形假丝酵母X11 48 h后接种酿酒酵母CEC01，接种体积比为1∶1、1∶5和1∶10）（编号为S1：1、S1：5和S1：10），在2 L发酵罐中进行微型发酵。以葡萄汁样品（赤霞珠葡萄破碎后过滤得到）为对照（编号为CK），发酵温度控制在25～27 ℃，每隔24 h进行压帽处理（使葡萄果皮与葡萄果汁充分接触）。当还原糖降至4 g/L以下时，加入50 mg/L的SO2（偏重亚硫酸钾0.1 g/L）终止发酵，得到赤霞珠葡萄酒。

1.3.3 基本理化指标的测定

总酸含量（以酒石酸计）的测定参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酸碱滴定法；酒精度的测定参照国标GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的密度瓶法；挥发酸含量（以醋酸计）：采用水蒸气蒸馏法；残糖（以葡萄糖计）：采用斐林试剂热滴定法。

1.3.4 挥发性化合物的测定

采用顶空固相微萃取气相色谱与质谱联用（HS-SPMEGC-MS）技术测定挥发性化合物。

挥发性化合物的提取：在15 mL顶空瓶中加入8 mL样品、1 g氯化钠，内标为2-辛醇（质量浓度为1 600 μg/L），放入微型磁力搅拌转子，密封。在磁力加热搅拌器上40 ℃平衡15 min，再萃取15 min，解吸5 min。

气相色谱条件[16]：DB-WAX毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。无分流进样，进样口温度为250 ℃，载气为超纯氦气（He）（纯度99.99%），流速1 mL/min。升温程序：以3 ℃/min从40 ℃升到130 ℃，再以4 ℃/min从130 ℃升到250 ℃，保持8 min。质谱条件：传输线温度250 ℃；离子源温度250 ℃；电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；质量扫描范围25～350 m/z，间隔为0.2 s。

定性定量方法[17]：采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）质谱数据库检索，结合保留时间进行定性分析。定量分析：采用内标法进行半定量分析，挥发性化合物含量通过峰面积/内标面积×内标浓度计算。

1.3.5 数据处理

实验数据采用Excel 2016进行数据统计、SPSS 18.0进行数据分析，多组分间比较使用One-way方差分析（analysis of variance，ANOVA）法、不同菌株发酵葡萄酒样中香气成分主成分分析（principal component analysis，PCA）；不同菌株发酵葡萄酒样中挥发性化合物聚类分析（cluster analysis，CA），采用Origin 8.5进行作图。每个样品重复处理3次。

2 结果与分析

2.1 赤霞珠葡萄酒理化指标

发酵结束后各处理酒样的基本理化指标见表1。由表1可知，所有不同菌株发酵葡萄酒样品的理化指标符合国标要求，残糖含量均低于4 g/L，酒精度约为13%vol。不同发酵方式的赤霞珠葡萄酒中挥发酸和总酸含量之间呈现一定差异，样品KF与混合发酵葡萄酒样品中挥发酸与总酸含量均高于样品NF，其中样品KF中总酸含量最高（6.41 g/L），样品G1：5中挥发酸含量最高（0.46 g/L）。所有酒样中总酸含量无显著差异，而共同接种混合发酵葡萄酒样品中挥发酸的含量均高于顺序接种混合发酵。样品S1：10的酒精度最高（14.09%vol），其次是样品S1：5（13.76%vol）、样品S1：1（13.69%vol），表明顺序接种发酵方式的酒精发酵更彻底。

表1 不同菌株发酵赤霞珠葡萄酒样品的基本理化指标Table 1 Basic physical and chemical indexes of Cabernet Sauvignon wine fermented by different strains

2.2 赤霞珠葡萄酒挥发性香气成分

葡萄酒中的多种挥发性化合物对葡萄酒的香气与风味有着重要的影响，本研究对不同菌株发酵葡萄酒样品进行挥发性香气成分分析，结果见表2。由表2可知，不同菌株发酵葡萄酒样品中共检出38种挥发性香气化合物，其中包括8种醇类、8种脂肪酸、16种酯类、4种苯乙基类物质以及2种其他物质。葡萄汁样品（CK）中共检出29种挥发性香气成分，与发酵处理的葡萄酒样品中香气物质组成种类和含量均存在显著差异（P＜0.05）；然而，不同发酵方式香气物质组成种类间没有显著差异（P＞0.05），但香气物质含量间存在显著差异（P＜0.05）。

醇类是葡萄酒中重要的香气组成成分，与样品NF相比，样品KF和混合发酵葡萄酒样品中醇类含量升高，其中样品G1：10葡萄酒样品中醇类含量最高（68 055.58 μg/L）。葡萄酒样品中的醇类含量均高于葡萄汁样品（CK），这说明酿酒酵母CEC01以及星形假丝酵母X11在葡萄酒发酵过程中能够产生大量的醇类，对提升葡萄酒的感官品质有重要意义。两组单菌发酵的葡萄酒样品NF与KF中，样品KF的醇类物质含量（16 160.11 μg/L）显著高于样品NF（9 399.25 μg/L）（P＜0.05），这表明了星形假丝酵母X11的代谢活动能给葡萄酒带来更多的醇类[18]。与单菌发酵的两组葡萄酒样品对比，混合发酵葡萄酒样品中醇类均高于单菌发酵，并且随着星形假丝酵母X11的接种比例上升，葡萄酒样品中醇类也呈现上升趋势，这与非酿酒酵母的存活时间与存活数量有关[19]。

酯类是葡萄酒中香气的主要贡献者之一，可以赋予葡萄酒花香与果香[20]。葡萄酒样品中的酯类含量在5 085.77～12 546.74 μg/L之间，显著高于葡萄汁中的624.42 μg/L（P＜0.05）。单菌发酵的两组葡萄酒样品中，样品KF的酯类含量（8209.05μg/L）显著高于样品NF组（5085.77μg/L）（P＜0.05）；在混合发酵葡萄酒样品中，随着星形假丝酵母X11的接种比例上升，酯类的含量显著升高，这与ESCRIBANO R等[21]在non-Saccharomyces中的研究结果相似。乳酸丙酯能赋予葡萄酒奶酪味和果香味，在顺序接种发酵过程中乳酸丙酯含量显著增加，其中以样品S1：5葡萄酒样品中乳酸丙酯含量最高（7 079.96 μg/L），为样品NF（2 810.51 μg/L）的2.52倍，这可能是在顺序发酵过程中酿酒酵母CEC01与星形假丝酵母X11的互相作用促进了乳酸丙酯的生成[22]。

苯乙基类化合物能赋予赤霞珠葡萄酒花香与果香[23]，本研究中共检测出4种苯乙基类化合物，在葡萄酒样品中的总含量在1 078.91～13 483.72 μg/L之间，均显著高于葡萄汁样品（CK）中的总含量（108.83 μg/L）（P＜0.05），其中苯乙醇可以赋予葡萄酒玫瑰香愉悦气味[24]。结果表明，发酵处理的葡萄酒样品中苯乙醇含量均高于葡萄汁；在样品KF与混合发酵葡萄酒样品中苯乙醇的含量显著高于样品NF（P＜0.05），并且随着星形假丝酵母X11的接种比例升高，葡萄酒样品中苯乙醇含量有显著增加。结果表明，星形假丝酵母X11具有高产苯乙醇的能力，这与ANDORRÀ I等[25]研究结果相似。

一般认为脂肪酸会给葡萄酒风味带来负面影响，但这类物质能抑制葡萄酒中的芳香酯水解[26]。本研究中共检测出8种脂肪酸，在顺序接种的葡萄酒样品中脂肪酸类物质总量（3 364.8 μg/L）低于共同接种的葡萄酒样品（3 876.46 μg/L）。高浓度的脂肪酸会带来葡萄酒风味带来不良影响，但低浓度的脂肪酸可以促进相应酯类的合成。

表2不同菌株发酵赤霞珠葡萄酒香气成分含量测定结果Table 2 Determination results of aroma components content in Cabernet Sauvignon wine fermented by different strains

不同菌株发酵葡萄酒样品中挥发性化合物种类及相对含量见图1。由图1可知，高接种比例星形假丝酵母X11的赤霞珠葡萄酒样品（G1：10与S1：10）中醇类的相对含量显著高于其他赤霞珠葡萄酒样品，但赤霞珠葡萄酒样品中酯类的相对含量与星形假丝酵母X11接种比例呈现负相关，所有葡萄酒样品中苯乙基类物质的相对含量无显著差异，而酸类与其他物质的相对含量水平有限。然而，赤霞珠葡萄酒样品与葡萄汁样品（CK）中所有物质的相对含量都存在显著差异。研究表明，不同发酵方式导致赤霞珠葡萄酒中各物质组分的相对含量不同，对赤霞珠葡萄酒的香气品质有重要影响。

图1 不同菌株发酵葡萄酒样品中挥发性化合物的种类及相对含量Fig. 1 Types and relative contents of volatile compounds in wine samples fermented by different strains

2.3 不同菌株发酵葡萄酒挥发性香气物质的主成分分析和聚类分析

本研究对39种挥发性香气物质含量进行了主成分分析（PCA）和聚类分析（CA），结果分别见图2和图3。

图2 不同菌株发酵葡萄酒样品中挥发性化合物主成分分析结果Fig. 2 Principal component analysis results of volatile compounds in wine samples fermented by different strains

图3 不同菌株发酵葡萄酒样挥发性化合物聚类分析结果Fig. 3 Cluster analysis results of volatile compounds in wine samples fermented by different strains

由图2可知，主成分1（PC1）的方差贡献率为71.2%，主成分2（PC2）的方差贡献率为13.2%，累计方差贡献率达到了84.4%，基本可以解释原始变量的大部分变异信息。两种单菌发酵方式之间无显著差异，但与CK的差异较大。根据不同的出发菌株，样品NF、KF位于PC1的负半轴，样品S1：10、S1：5、G1：10、G1：5位于PC1的正半轴；根据混合发酵的不同接种方式，顺序接种方式的葡萄酒样品均位于PC2的负半轴，共同接种的样品G1：10位于PC2的正半轴；根据混合发酵中不同的接种比例，样品S1：10、G1：10、S1：5、G1：5位于PC1的正半轴，样品S1：1、G1：1位于PC1的负半轴，说明不同接种方式和酿酒酵母CEC01与星形假丝酵母X11的不同接种比例对赤霞珠葡萄酒的挥发性香气化合物有重要影响。

由图3可知，混合发酵样品S1：10和G1：10中大部分香气化合物含量较高，其中样品S1：10中乙酸乙酯、己酸乙酯、癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇含量较高；样品G1：10中苯甲醇、甲酸正己酯、苯乙酸乙酯含量较高。不同发酵处理方式间挥发性香气化合物含量差异较大，混合发酵葡萄酒样品中大部分挥发性香气化合物含量高于酿酒酵母CEC01单菌发酵葡萄酒样品，样品G1：10与S1：10样品中香气化合物含量显著高于其他赤霞珠葡萄酒样品（P＜0.05），且具有更多的特征性香气化合物。结果表明，高接种比例星形假丝酵母X11的混合发酵方式对赤霞珠葡萄酒的香气产生积极影响。

2.4 星形假丝酵母X11对葡萄酒风味的影响

葡萄酒中挥发性化合物的种类与含量与葡萄酒香气品质有密切的联系[27]。本研究对22种（其中包括15种酯类、5种醇类、5种脂肪酸类、2种苯乙基类化合物以及1种其他物质，OAV＞0.1）挥发性香气化合物进行了气味活性值（odor activity value，OAV）（OAV=挥发性香气化合物浓度/挥发性香气化合物阈值[28]）分析结果见表3。

表3 不同菌株发酵对赤霞珠葡萄酒气味活性值的影响Table 3 Effect of different strains fermentation on the odor activity value of Cabernet Sauvignon wine

当OAV＞1时，认为该化合物为葡萄酒的特征性香气化合物；OAV＞0.1时，挥发性化合物可能通过与其他化合物的协同、抑制、组合等作用对葡萄酒的香气品质产生影响[16]。由表3可知，OAV＞1的挥发性化合物在样品CK、NF、KF中分别检测到3种、6种、8种，混合发酵葡萄酒样品G1：1中检测到的种类最少为7种，而样品S1：10、G1：10中检测到种类最多为16种，高接种比例星形假丝酵母X11的混合发酵方式能提高赤霞珠葡萄酒的香气复杂性。

在检出的22种挥发性化合物中，己酸乙酯、异戊醇、己酸乙酯、癸烯酸乙酯、乙酸乙酯和苯乙醇在所有混合发酵葡萄酒和KF组样品中OAV均＞1，而乳酸丙酯在样品NF中OAV为0.8，未发酵的葡萄汁样品中只有己酸乙酯的OAV＞1。苯乙醇的OAV随着星形假丝酵母X11的接种比例上升而增加，这表明了星形假丝酵母X11可以给赤霞珠葡萄酒带来浓郁的玫瑰香气。

选取酒样中OAV＞0.1的香气物质，根据这些物质的香气类型绘制赤霞珠葡萄酒的香气雷达图见图4。由图4可知，所有试验酒样香气以玫瑰香味为主，其次为奶酪味、青草味、果香味和脂肪味。结果表明，不同发酵方式的葡萄酒中青草味和脂肪味无显著差异；其中混合发酵S1：1中具有最浓郁的奶酪味，混合发酵样品S1：10中具有最浓郁果香味和玫瑰香味；混合发酵葡萄酒和星形假丝酵母X11单菌发酵葡萄酒中玫瑰香味均比酿酒酵母CEC01单菌发酵葡萄酒强烈，并且相同接种比例的顺序接种混合发酵葡萄酒中玫瑰香味均比共同接种混合发酵葡萄酒强烈。综上可知，星形假丝酵母X11能够增强赤霞珠葡萄酒的玫瑰香味特征，与高接种比例星形假丝酵母X11的混合发酵显著提高了赤霞珠葡萄酒样品中苯乙醇含量有关，并且混合发酵中顺序接种方式优于共同接种方式，这与BENITO S等[33]研究结果相似。

图4 不同菌种发酵葡萄酒样品挥发性香气成分的风味雷达图Fig. 4 Flavor radar chart of volatile aroma components in wine samples fermented by different strains

3 结论

目前葡萄酒的酿造方式大部分是采用酿酒酵母进行纯种发酵，造成了葡萄酒风味的单一化。本研究采用HSSPME-GC-MS技术测定酿酒酵母CEC01和星形假丝酵母X11单菌发酵、共同发酵和顺序发酵葡萄酒中的挥发性香气化合物，探讨星形假丝酵母X11强化赤霞珠葡萄酒玫瑰香气的条件。星形假丝酵母X11的单菌发酵和混合发酵葡萄酒中苯乙醇含量显著高于酿酒酵母CEC01单菌发酵（P＜0.05）。随着星形假丝酵母X11接种比例的增加，苯乙醇的含量显著增加（P＜0.05）。因此，本研究认为星形假丝酵母X11具有提升葡萄酒玫瑰香气的应用潜力；结果表明，酿酒酵母CEC01与星形假丝酵母X11 以1：10接种比例的顺序接种发酵方式能够有效改善葡萄酒风味单一化的问题。