我国特色发酵蔬菜降解亚硝酸盐菌株的筛选鉴定及应用

忻晓庭，刘大群，张程程，吴 敏，陈登高，章检明，*

(1.浙江省农业科学院 食品科学研究所，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021；2.浙江大学 生命科学学院，浙江 杭州 310058；3.浙江三统菜业有限公司，浙江 绍兴 312000)

我国是蔬菜第一生产大国，近年来为解决我国新鲜蔬菜浪费严重的问题，许多对蔬菜发酵方面的研究应运而生[1-3]。发酵蔬菜种类繁多，包括酱腌菜、泡菜、酸菜等，市面上常见的有四川泡菜、东北酸菜、榨菜、雪菜、酸豆角等。发酵蔬菜酸鲜可口，香味浓郁，开胃下饭，是人们离不开的日常小菜[4-5]。但自然发酵的蔬菜，发酵品质不一，发酵周期较难控制，

杂菌较多，易出现亚硝酸盐超标现象。因此，发酵蔬菜的食品安全问题不容忽视。亚硝酸盐含量是发酵蔬菜加工贮藏过程中不可忽视的一个重要指标[6-7]。亚硝酸盐摄入过多会对人体产生多种危害，主要包括形成亚硝胺致癌物质以及引发高铁红蛋白症[8]，威胁人体健康。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构将导致内源性亚硝化条件下摄入的硝酸盐或亚硝酸盐归为2A类致癌物。我国食品中污染物限量规定蔬菜及其制品中腌渍蔬菜所含亚硝酸盐的限量不得超过20 mg·kg-1[9]。

乳酸菌是蔬菜发酵中的主要菌群。发酵过程中，乳酸菌能迅速增殖产酸，制造厌氧环境，有效阻止一些有害微生物的活动，且乳酸菌具有调节肠道菌群、控制人体肠道微生态平衡、预防胃肠道疾病、降低血清胆固醇以及增强免疫力等功能。Kim等[10]研究发现，乳酸菌还有多种益生菌功能。近年来，许多研究表明，从发酵蔬菜中筛选出的部分乳酸菌能显著降低泡菜中亚硝酸盐的含量[11-12]。张庆芳等[13]对乳酸菌降解亚硝酸盐机理研究表明，发酵前期，乳酸菌以亚硝酸盐还原酶降解为主，产生的亚硝酸盐还原酶将发酵蔬菜中的亚硝酸盐还原。Yang等[14]研究表明，在发酵至pH低于5时，亚硝酸盐以酸降解为主，乳酸菌代谢产生大量酸，抑制了杂菌的生长繁殖和硝酸还原酶的活力，H+与亚硝酸盐发生非酶歧化反应等都促使了亚硝酸盐含量的降低。因此，筛选高效降解亚硝酸盐能力的优良菌株，运用于现代发酵蔬菜标准化生产，以提高发酵蔬菜的产品质量与安全性，是发酵蔬菜生产的关键技术措施[15]。本文收集了我国多地的不同种类发酵蔬菜，旨在从中筛选出具有高效降解亚硝酸盐能力，并且具有耐酸耐胆盐以及耐盐性能与产酸能力优良的菌株，为满足发酵蔬菜产业对安全性能高的优质菌种资源的需求提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

特色发酵蔬菜来源见表1。

表1 特色发酵蔬菜来源Table 1 Source of characteristic fermented vegetables

1.1.2 试剂

MRS液体培养基、MRS固体培养基、加亚硝酸钠的MRS液体培养基、加碳酸钙的MRS固体培养基，基础培养基由赛默飞世尔科技公司提供。

亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼砂、盐酸、氯化钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；人工胃液、人工小肠液、林格试剂，上海源叶生物科技有限公司；牛胆盐，海博生物技术有限公司。

1.1.3 仪器与设备

YXQ-50SII型高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9272型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Nikon eclipse 50i电子显微镜，上海市衡浩仪器有限公司；Hitachi Regulus 8100冷场发射扫描电镜、E-1045镀金仪，日本日立公司；UV-2600型紫外分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；METTLER TOLEDO精密pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DW-9A型微生物试剂分液器，杭州大微生物有限公司；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

分别称取10 g样品，加入90 mL无菌生理盐水，均质后做10倍系列稀释。取10-6、10-7、10-8各稀释度0.1 mL液体分别涂布于加碳酸钙的MRS固体培养基平板上，37 ℃培养48 h，挑选溶钙圈较大的典型单菌落，在MRS平板上反复划线，获得纯菌株。对菌株进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶试验[16]，并将菌株保存于-80 ℃下加有20%甘油的MRS培养基中。

革兰氏染色镜检。制片：取菌种培养物常规涂片，干燥，固定；初染：滴加结晶紫染色1～2 min，水洗；媒染：用碘液冲去残水并用碘液覆盖约1 min，水洗；脱色：吸去残水，将载玻片倾斜，在白色背景下用流动的95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即水洗；复染：甲基红染液复染2 min，水洗，干燥后用油镜观察。

过氧化氢酶试验：取培养18 h的菌株，涂抹于滴有3%过氧化氢的载玻片上，如产生气泡则为阳性，无气泡为阴性。

1.2.2 降解亚硝酸盐菌株的筛选

将初步筛选出的菌株接种于MRS液体培养基，37 ℃培养活化18 h，取菌龄为16 h的培养液，按2%接种量接种于10 mL含NaNO2约250 mg·L-1的MRS液体培养基中，37 ℃培养16 h，以含亚硝酸钠未接种培养基为对照，选取降解亚硝酸盐能力强的菌株，进行下一步试验。亚硝酸盐降解率(%)=(对照组亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/对照组亚硝酸盐含量×100。亚硝酸钠的测量方法用盐酸萘乙二胺分光光度法[17]。

1.2.3 耐酸耐胆盐菌株的筛选

试验方法参照徐晶雪等[18]并做修改。将培养16 h的新鲜菌液混匀，分别取2 mL至2 mL离心管，重复三管分别标记CT、GJ、BJ，7 500×g4 ℃离心5 min，去上清液，用无菌生理盐水洗涤两遍，离心，弃去上清液。模拟胃肠道消化环境，在洗涤完的离心管中均加入100 μL生理盐水重悬，在CT中加入900 μL林格试剂，GJ中加入900 μL人工胃液，BJ中加入900 μL人工小肠液，混匀，置于37 ℃培养箱孵育3 h。取出培养液，7 500×g4 ℃离心5 min，弃去上清液，加入2 mL MRS液体培养基，混匀后取20 μL CT、GJ管中的菌液加入到1 mL MRS液体培养基中，取20 μL BJ管中的菌液加入到1 mL添加0.3%牛胆盐的MRS液体培养基中，混匀，取200 μL到96孔板中，用酶标仪在波长620 nm处测定24 h各个时段的吸光值，培养温度为37 ℃，测量间隔0.5 h，绘制生长曲线。

1.2.4 菌株分子生物学鉴定

扫描电镜：制样方法参照文献[19]将筛选出的菌株活化，取2 mL新鲜菌液离心，弃去培养基，用戊二醛固定12 h，用无菌水洗涤，去除戊二醛，然后分别用40%、70%、90%、100%乙醇脱水处理15 min，真空干燥，喷金，用扫描电镜对菌体形态进行观察。

DNA的提取：参照文献[20]进行提取。挑取在MRS固体培养基上纯化后的乳酸菌菌落，采用DNA提取试剂盒提取DNA，并对菌株的16S rDNA进行PCR扩增。上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1495R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR扩增：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，31个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

分子生物学鉴定采用16S rDNA序列比对的方法[21]。由生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA测序，与NCBI上标准序列比对，将测定的序列用BLAST( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank数据库中与已知细菌的16S rDNA基因片段序列进行比较。从GenBank数据库中，下载已知乳酸菌属标准菌株的16S rDNA基因序列，用Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.2.5 菌株的耐盐性及生物学测定

生长曲线：将筛选出的菌株活化，制备菌悬液，按2%接菌量接种到MRS培养基中，混匀，取200 μL到96孔板中，用酶标仪在波长620 nm处测定24 h各个时段的吸光度，培养温度为37 ℃，测量间隔0.5 h，绘制生长曲线。

耐盐性[22]：配制含6%NaCl的MRS液体培养基，将筛选出的菌株活化，制备菌悬液，按2%接菌量依次接种到配制好的高盐MRS液体培养基中，混匀，取200 μL到96孔板中，用酶标仪在波长620 nm处测定24 h各个时段的吸光度，培养温度为37 ℃，测量间隔0.5 h，绘制生长曲线。

产酸能力以及降解亚硝酸盐能力：将筛选出的菌株活化，制备菌悬液，按2%接菌量依次接种到配制好的含250 mg·L-1MRS液体培养基中，37 ℃培养，分别在0、5、10、15、20、25、30 h测定pH以及亚硝酸钠含量。

1.2.6 高效降解亚硝酸盐菌株在泡菜中的应用

菌株在发酵蔬菜中的应用参照杜晓华等[23]的方法略作改动。将筛选得到的菌株在MRS液体培养基中培养16 h，按体积质量比1%的接种量接种发酵制作泡菜。每12 h取样测定泡菜的pH、亚硝酸盐含量，直到发酵成熟，与自然发酵泡菜进行比较，研究菌株在发酵泡菜过程中降解亚硝酸盐的能力。

2 结果与讨论

2.1 降解亚硝酸盐菌株的筛选结果

从培养皿中挑取溶钙圈较大的菌株，划线纯化得到纯菌株，从中挑选出革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株72株。李梓铭[24]研究显示，可将具有明显溶钙圈、革兰氏染色为阳性、接触酶反应为阴性的乳白色或白黄色且表面圆滑的菌落初步确定为乳酸菌。因此，初步可判定这72株菌为乳酸菌并作为进一步研究对象。将72株菌进行降解亚硝酸钠实验，由表2可知，72株菌株对亚硝酸钠的降解能力在4.931%～99.347%，其中30株菌株的亚硝酸钠降解率达85%以上。这与肖秋颖等[25]研究结果相似，其研究结果显示，亚硝酸钠降解率在80%以上的菌株占50%以上，表明大部分乳酸菌都有一定的亚硝酸钠降解能力。

续表2 Continued Table 2

2.2 乳酸菌耐酸耐胆盐结果

乳酸菌对外界环境较为敏感，作为益生菌进入人体肠道内，各种消化液、酶也会对其生存与繁殖产生影响，因此对筛选得到的具有较强亚硝酸钠降解能力的菌株进行耐酸耐胆盐试验，得到结果如表3。结果显示：在常规生长环境中，21株乳酸菌生长良好；经人工胃液处理的18株乳酸菌生长良好，表现出了耐酸性；30株乳酸菌耐胆盐性普遍一般，其中有8株有相对较好的耐胆盐能力。综合降亚硝酸盐、耐酸、耐胆盐的结果，JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6五株乳酸菌兼具良好的耐酸耐胆盐能力，能适应消化道环境，可作为发酵菌株应用于发酵蔬菜。

表3 耐酸耐胆盐测定结果Table 3 Test results of acid and bile salt resistance

续表3 Continued Table 3

2.3 高效降解亚硝酸盐菌株的形态学鉴定以及分子生物学鉴定结果

2.3.1 菌落形态以及扫描电镜结果

将上述筛选的具有较强降解亚硝酸钠能力以及耐酸耐胆盐能力的5株菌株进行形态学分析。5株菌的菌落形态如图1所示。由图1可以看出，菌株JLSC1-1和JLSC2-6的菌落形态相似，在MRS固体平板上直径为1.0～1.5 mm，白色，略透明，圆形，边缘整齐表面光滑，稍隆起。菌株HNLJJ-2在MRS固体平板上直径为1.0 mm，乳白色，不透明，圆形，边缘整齐表面光滑，隆起。菌株CXG-1的菌落形态与CXG-6相似，在MRS固体平板上直径为1.0～1.5 mm，乳白色，不透明，圆形，边缘整齐表面光滑，隆起。对5株菌进行电镜扫描，结果如图2。图2显示，菌株JLSC1-1、JLSC2-6、CXG-1和CXG-6形态相似，均为短杆状，JLSC1-1和JLSC2-6菌表面光滑，且JLSC2-6菌体稍长；CXG-1和CXG-6表面粗糙，且CXG-1稍长。菌株HNLJJ-2为短杆状，比前两株长且表面光滑。

2.3.2 菌株16S rDNA基因序列分析

将菌株JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6的16S rDNA序列结果在NCBI上进行BLAST比对，选取部分同源性较高的不同菌株，用Neighbor-joining法构建系统发育树，结果见图3。

经鉴定，5株菌均为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。JLSC1-1与Lactobacillusplantarumstrain 2945、Lactobacillusplantarumstrain CAU：225、Lactobacillusplantarumstrain 5137有100%的同源性。JLSC2-6与Lactobacillusplantarumstrain 3335、Lactobacillusplantarumstrain 3742有100%的同源性。HNLJJ-2与Lactobacillusplantarumstrain 7071有100%的同源性。CXG-1与Lactobacillusplantarumstrain 1888、Lactobacillusplantarumstrain 6541有99.86%的同源性。CXG-6与Lactobacillusplantarumstrain Heal19、LactobacillusplantarumSN13T有100%的同源性。结合菌落形态、菌株形态以及16S rDNA鉴定结果，将JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6均鉴定为植物乳杆菌。

2.4 乳酸菌生长性能

2.4.1 乳酸菌生长曲线

由图4可知，5株菌均有良好的长势，在培养2 h后进入对数生长期，培养12 h后进入稳定期。菌株HNLJJ-2与CXG-1在对数生长期生长较快。在稳定生长期，JLSC2-6、HNLJJ-2与CXG-1长势相似，且均比JLSC1-1与CXG-6具有更高的D值。

此生长趋势与大部分植物乳杆菌的生长趋势相同。

2.4.2 乳酸菌产酸性能

5株菌发酵时培养基的pH变化如图5所示。5株菌发酵时pH持续降低，15 h后逐渐稳定在3.7左右，且它们的pH变化趋势基本一致，表明5株菌均有良好的产酸能力。

2.4.3 乳酸菌耐盐实验结果

大部分发酵蔬菜中，盐含量往往较高。高浓度的盐溶液能有效抑制一些有害微生物的生长，但盐浓度过高对发酵乳酸菌也会产生抑制作用[26]。对筛选出的5株菌在高盐浓度(盐含量为6%)下进行耐盐试验，这5株菌的生长结果见图6。

相对初始的D值，5株菌的D值均有不同程度的上升，但生长状况均有所抑制。0～12 h时，HNLJJ-2生长最快，其次是JLSC2-6，JLSC1-1生长最慢。12～24 h时，JLSC2-6一直保持着较其他4株菌长势好，而JLSC1-1长势较慢。表明5株菌中，JLSC2-6的耐盐性比其他菌株更强。

2.4.4 乳酸菌的亚硝酸钠降解曲线

5株菌的亚硝酸钠降解曲线如图7所示，对亚硝酸钠的降解率均在15 h后趋于稳定，在20 h后均能达到98%以上。而在发酵的前15 h，JLSC2-6的亚硝酸钠降解率始终高于其他菌株，在发酵10 h时，其降解率已达到87.52%。发酵30 h后，其降解率高达99.06%。结果表明，菌株JLSC2-6相比于其他4株菌具有更优良的降解亚硝酸钠能力，能更快速降解发酵蔬菜中产生的亚硝酸盐。

2.5 高效降解亚硝酸盐菌株在泡菜中的应用

选用耐酸、耐胆盐、耐盐以及降解亚硝酸盐能力强的菌株JLSC2-6进行应用试验，将JLSC2-6活化后按1%接种量接种制作泡菜，以自然发酵泡菜做对照，分别添加30 mg·kg-1NaNO2，考察JLSC2-6在泡菜发酵过程中对亚硝酸钠的降解作用。发酵过程中pH与亚硝酸钠含量变化如图8和图9所示。

由图8可知，接种菌株JLSC2-6发酵的泡菜产酸速度显著高于自然发酵的泡菜，发酵12 h时pH为3.54，而后pH一直处于3.5以下且呈稳定状态。自然发酵的泡菜发酵48 h后pH降至3.9，发酵72 h后pH才降至3.5以下。自然发酵前期，杂菌较多，乳酸菌处于繁殖阶段，酸性环境尚未形成，后期随着发酵的进行乳酸菌大量繁殖，pH下降。而接种发酵前期接入大量的乳酸菌，产生了大量的酸，快速降低了pH，抑制了杂菌的繁殖。

泡菜发酵过程中亚硝酸钠含量变化见图9，发酵12 h时，接种发酵的泡菜中亚硝酸钠含量显著下降，降至2.69 mg·kg-1，且持续下降，36 h回升至2.37 mg·kg-1，而后持续下降，84 h后降至1 mg·kg-1以下。而自然发酵的泡菜中亚硝酸钠含量降至20.86 mg·kg-1后又急剧升高，到36 h时出现亚硝峰，此时泡菜中亚硝酸钠含量高达87.37 mg·kg-1，而pH为4.23，直至60 h后亚硝酸钠含量才降解至20 mg·kg-1以下。此结果与黄丽慧等[27]的研究结果一致，大量研究表明，自然发酵的蔬菜腌渍过程中亚硝酸盐含量均呈现先增加后减少的变化趋势，且在pH为4左右时出现亚硝峰现象，而后亚硝酸盐含量下降。试验表明菌株JLSC2-6在泡菜发酵过程中能高效降解泡菜发酵过程中原有的以及产生的亚硝酸盐。此结果与杜晓华等[23]的研究结果相似，以植物乳杆菌N2按10%的接种量接种发酵制作泡菜，有效降解了发酵蔬菜中的亚硝酸盐。

3 结论

本研究从农家自制、腌制蔬菜工厂以及实验室自制的酱腌野生菌、臭菜梗、酸菜、辣椒酱、雪菜以及泡菜中分离出72株菌，初步判断为乳酸菌。从中筛选出30株具有良好降解亚硝酸钠能力的菌株，通过耐酸耐胆盐实验，得到5株能适应消化道环境具有益生菌性能的菌株JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6，综合形态学鉴定以及分子生物学鉴定结果，确定5株菌均为植物乳杆菌。对其进行性能初步探究发现，JLSC2-6具有优良的生长繁殖能力，产酸性能和耐盐性以及高效降解亚硝酸盐能力。将其应用于发酵蔬菜的制作，能有效降低发酵过程中产生的亚硝酸钠，其降解机理以及其他方面的益生菌功能等还有待进一步研究。