17份黄金菊茶树自然杂交单株的表型变异与资源价值评价

王治会，彭 华，杨普香，*，江新凤，李文金，岳翠男，李 琛，李延升

(1.江西省蚕桑茶叶研究所/江西省茶叶质量与安全控制重点实验室，江西 南昌 330202；2.江西省经济作物研究所 ，江西 南昌 330202)

白化、黄化茶树属于茶树中的珍稀资源，是一类代谢机制特异的叶色突变体[1-2]。用此类叶色突变体为原料制作的茶产品，因形美香高、滋味鲜爽、苦涩味低而受到消费者青睐，使其经济价值更高，已成为各地茶企茶农增收的重要途径[3]。黄金菊为黄化茶树品种中的一种，是20世纪80年代江西省修水县茶叶科学研究所科研人员从宁州群体种中经单株优选培育而成，嫩梢芽叶呈黄色，似菊花而得名[4]；后引种到赣中丘陵地区江西省蚕桑茶叶研究所，未因地理环境不同而改变其特性[5]。江西省蚕桑茶叶研究所科研人员将黄金菊自然杂交的种子播种之后，萌发率高，且其实生苗单株表型差异性极大，芽叶色泽与叶片性状多样，为叶色特异资源筛选提供了另外一种可能性，且极具筛选优异单株的潜力。

自然杂交指的是近期或者历史上自然发生的没有受到人为因素干扰的物种杂交事件，是植物物种形成的主要驱动力[6]，不仅可以增加遗传多样性和物种的适应性，而且可以导致物种的辐射式演化，促进大量物种在相对较短的时期内形成，也可增加物种对植食作用、病原体和寄生虫压力的抗性，在应对气候剧变、虫害爆发、病原菌等环境压力时，可能会表现更出色[7-9]。沈红香等[10]对王族观赏海棠的自然杂交遗传多样性进行研究，结果表明，其在形态和分子遗传水平上都具有丰富的多样性，尤其在形态上的差异更为显著，这些变异为观赏海棠的品种育种提供了良好材料。王玉等[11]的研究结果表明，玫瑰自然杂交后代的遗传多样性丰富，亲本来源的多样性使得玫瑰的分类体系增加了2个类系，为培育玫瑰新品种提供材料与依据。赵丽娜等[12]对蓝莓的自然杂交品系进行综合评价，从中筛选到了5个优良品系。范凯等[13]研究表明，茶树黄山种自然杂交后代发生了基因的分离和重组，产生了丰富的遗传变异，部分单株一芽三叶长、百芽质量较大，为后续系统选种提供了优异种质材料。杨军等[14]对茶树6个自然杂交群体进行研究，发现各群体遗传多样性差异不同，福云6号最高，白鸡冠、悦茗香、紫玫瑰相当，金观音、金牡丹次之。本研究以前期标记的17份芽叶性状表现较好的黄金菊自然杂交单株为材料，鉴定其23项表型性状，分析其表型变异与Shannon-Weaver多样性，从中筛选表型优良单株，分析其生化成分差异，最终利用主成分分析进行生化品质评价。以期明确黄金菊自然杂交单株的表型变异与多样性，从中筛选优良单株，为进一步探索其自然杂交后表型变异的分子机理与开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品

2013年秋季，从黄化变异茶树品种黄金菊母株上采集种子，母株周边均为国内各区域茶树种质资源，位于江西省蚕桑茶叶研究所茶树品种园内。2014年春季进行播种，2017—2018年从中标记17份芽叶性状表现较好的单株，见图1。2018—2020年连续3 a对标记单株进行表型性状鉴定与生化成分分析，生化样品为春季采摘各单株一芽二叶鲜叶，采用微波杀青，然后于80 ℃烘干固样。

1.1.2 标准品

咖啡碱、没食子酸(GA)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素(EC)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素(C)等标准品的纯度为98%，购买于成都普瑞法科技开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 表型性状鉴定

参考《NY/T 2422—2013 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 茶树》，测定黄金菊生长势，结果为中等。以黄金菊为标准品种，比其生长势差的标记为弱，比其生长势好的标记为强；物候期测定以福鼎大白茶为对照，在春季固定观察单株越冬顶芽，当有三分之一达到一芽一叶时，即为此单株的一芽一叶期。一芽一叶期与福鼎大白茶相差在5 d之内的物候期为早，比福鼎大白茶晚5～10 d的为中，晚10 d以上的为晚；树型、树姿、叶片大小、叶片着生状态、叶形、叶色、叶基、叶身、叶尖、叶面、叶缘、叶质、叶齿形态、芽叶茸毛、叶长、叶宽、叶面积、叶脉对数、单芽长、一芽二叶长等测定参考《NY/T 1312—2007 农作物种质资源鉴定技术规程 茶树》；芽叶色泽为实际观察到的色泽。

1.2.2 生化成分测定

咖啡碱、儿茶素组分(GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG)含量测定采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为3‰冰乙酸溶液，流动相B为纯乙腈。流动相A：0～5 min为95%～92%，5～15 min为92%～88%，15～30 min为88%～80%，30～31 min为88%～0%，31～35 min为0%；流动相B：0～5 min为5%～8%，5～15 min为8%～12%，15～30 min为12%～20%，30～31 min为20%～100%，31～35 min为100%。进样量为10 μL，柱温为35 ℃，流速为1 mL·min-1；检测波长为278 nm。茶多酚含量测定参考国家标准GB/T 8313—2018，游离氨基酸含量测定参考国家标准GB/T 8314—2013，水浸出物含量测定参考国家标准GB/T 8305—2013。每个样品测定进行3次生物学重复。酚氨比=茶多酚含量/游离氨基酸含量，儿茶素苦涩味指数=(EGCG+ECG+EGC+GC)/(EC+C)。

1.3 数据处理

在对表型性状中的描述型性状进行数据分析时，先对各性状的描述等级进行赋值，然后进行统计分析。表型性状Shannon-Weaver多样性指数=-ΣXj×lnXj，Xj是某生化成分第j个级别出现的频率。

级别划分利用各性状指标平均数和标准差分为10级：第1级为Y1<(-2θ)，第10级为Y10≥(+2θ)。其中，为各性状指标的平均数，θ为各性状指标的标准差，每0.5θ为1级。数据描述性统计、LSD方差分析采用软件SPSS 19.0，柱状图制作采用Excel 2016，主成分分析、变异系数与多样性指数的分布图制作采用软件Origin 2018。

2 结果与分析

2.1 描述型性状的变异与多样性

17份自然杂交后代单株的描述型性状统计见表1，描述型性状的变异系数与多样性分布见图2。变异系数范围为0%～57.23%，均值为33.88%。从图2的变异系数分布图中可以看出，存在2个离群点，分别为树型和树姿，它们的变异系数均为0，说明经过自然杂交之后，其后代在树型与树姿2个性状上没有发生变异，树型均为灌木型，树姿均为开张。其他性状的变异较大，且分布较为均匀，变异系数高于均值的性状依次为芽叶色泽、芽叶茸毛、叶缘、物候期、叶质、叶面、生长势、叶齿形态、叶色、叶片大小。多样性指数范围为0～1.78，均值为0.81；从多样性指数分布图上来看，存在3个离群点，分别是树型、树姿和芽叶色泽，因树型和树姿这2个性状未发生变异，所以不存在多样性；芽叶色泽的多样性明显高于其他性状，主要原因在于芽叶色泽的变异系数最大，变异程度最高，所以自然杂交后代中产生了丰富的多样性，多样性指数高于均值的性状依次为芽叶色泽、叶色、生长势、物候期、叶尖、叶质、叶面、叶缘、叶齿形态、芽叶茸毛。江西省茶树种质资源的表型多样性均值为0.9，变异系数为35.32%[15]。与本研究相比，黄金菊自然杂交后代的变异系数与多样性稍低，但相差不大，由此说明黄金菊自然杂交后代的多样性极其丰富，遗传改良潜力巨大。

表1 描述型性状的描述性统计Table 1 Descriptive statistics of descriptive traits

黄金菊自然杂交后代的芽叶色泽极其多样化，包括8种，黄金菊本身为黄化变异品种，经过自然杂交之后，其颜色变异更加丰富，维持了母株芽叶黄色的有3株，浅黄色1株，紫黄色1株，紫色1株，绿色系列11株。叶片大小有2种类型，包括中叶和小叶，以小叶形为主，占比76%。叶片着生状态以上斜为主；叶形包括近圆形、椭圆形、长椭圆形这3种，以椭圆形为主，占比65%。叶色较为多样化，包括深绿、绿、浅绿和黄绿这4种。叶基有2种，主要为近圆形。叶身主要为内折。叶尖主要为渐尖，叶面主要为微隆起和平。叶缘主要为平。叶质主要为中和柔软。叶齿形态主要为锯齿形和少齿形。芽叶茸毛主要为少。生长势和物候期是茶树品种选育所关注的主要性状，生长势决定了茶树成活之后的生长能力，生长势越强，茶树的育芽能力越强，往往适应性越强。物候期与春茶上市时间息息相关，春茶上市时间越早，其经济价值越大。所以在资源筛选时，一般选择生长势较好和物候期较早的茶树品系[16-17]。黄金菊自然杂交后代中生长势达到强的有5个单株，占比29%，达到中的有7株，占比41%；物候期达到早的有4个单株，占比24%，达到中的有6株，占比35%。黄金菊母株的生长势为中，物候期为晚；在自然杂交后代中有7份生长势和物候期均在中等以上，分别为HJJ-1、HJJ-7、HJJ-9、HJJ-11、HJJ-12、HJJ-14和HJJ-17，这7份单株的表型性状表现较好。

2.2 数量型性状的变异与多样性

数量型性状的描述统计见表2，变异系数与多样性指数分布见图3，数量型性状的变异系数范围为10.33%～19.82%，均值为14.68%；从分布图上来看，没有离群点，呈两极分散，叶面积、单芽长和一芽二叶长变异较大，叶长、叶宽和叶脉对数变异较小。多样性指数范围为1.14～1.95，均值为1.75；从分布图上可以看出存在1个离群点，为叶脉对数，其他性状分布集中。叶脉对数的变异较小，其多样性程度最低。

表2 黄金菊自然杂交后代数量型性状的描述性统计Table 2 Descriptive statistics of quantitative traits in natural hybrid progenies of Huangjinju

2.3 化学成分差异性

通过对黄金菊自然杂交单株的物候期和生长势进行分析，筛选出7份表现较好的单株，其主要生化成分和LSD方差分析结果见表3。水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱是影响茶叶品质的重要次生代谢物质[18]。水浸出物含量影响茶汤浓度，其含量范围为35.67%～44.84%，HJJ-9、HJJ-14和HJJ-17的水浸出物含量与黄金菊无显著性差异(P>0.05)，另外4份单株的水浸出物含量显著低于黄金菊。游离氨基酸是茶汤鲜爽味的重要贡献成分，也是茶叶香气形成的关键因子，含量越高，茶叶品质越好[19]。7份单株中游离氨基酸含量范围为3.34%～4.47%，有6份高于黄金菊，HJJ-9、HJJ-12和HJJ-14的游离氨基酸含量显著(P<0.05)高于黄金菊。咖啡碱是茶汤苦味的主要贡献成分，也影响茶树的抗虫性与抗病性[19]，其含量范围为4.07%～4.66%，7份单株的咖啡碱含量均与黄金菊无显著(P>0.05)差异，说明黄金菊自然杂交后代中咖啡碱含量无明显变化。茶多酚对茶汤的苦涩味、色泽等有重要贡献，同时也影响茶树的抗虫性和抗病性[19]，其含量范围为15.32%～21.39%，除HJJ-9外，其他6个单株的茶多酚含量均显著(P<0.05)低于黄金菊。酚氨比对茶叶适制性有参考意义，一般认为比值高的茶叶适制红茶，低的适制绿茶[20-21]。7份单株的酚氨比范围为3.46～5.20，均显著(P<0.05)低于黄金菊。

表3 黄金菊自然杂交后代主要生化成分的差异分析Table 3 Difference analysis of main biochemical components in natural hybrid progenies of Huangjinju

续表3 Continued Table 3

儿茶素对茶汤的苦涩味有重要贡献，包括简单儿茶素和酯型儿茶素，儿茶素苦涩味指数越大，苦涩味越重，能够在一定程度上反映儿茶素品质[22-24]。7份单株的总儿茶素含量为11.67%～17.71%，均显著(P<0.05)低于黄金菊。酯型儿茶素的变化趋势与总儿茶素相同；而简单儿茶素的变化趋势与总儿茶素相反，7份单株中有6份高于黄金菊，其中4份显著(P<0.05)高于黄金菊。苦涩味指数范围为4.69～10.72，除HJJ-14外，其他6份单株的苦涩味指数显著(P<0.05)低于黄金菊。

从上述生化成分分析可以看出，黄金菊在自然杂交之后，除咖啡碱在各单株中无显著差异之外，其他各成分之间均有显著差异。自然杂交后代部分单株的游离氨基酸和简单儿茶素含量显著(P<0.05)提高；茶多酚、总儿茶素、酯型儿茶素含量，以及酚氨比和苦涩味指数显著(P<0.05)降低。这些改变对茶树鲜叶制茶品质提升具有重要作用，说明能够从这些自然杂交后代中筛选出生化成分优良的单株。

2.4 优选单株综合评价

《非主要农作物品种登记指南 茶树》中以水浸出物、茶多酚、游离氨基酸和咖啡碱作为茶树品种品质分析的主要成分。儿茶素苦涩味指数能够体现儿茶素品质[22]，所以本研究以水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱和儿茶素苦涩味指数为变量，采用主成分分析对筛选的7份表型性状较好的单株进行生化成分综合评价，评价结果见图4。提取的前2个主成分能够解释85.5%的变异，说明模型的解释度较高。最终建立的综合评价指数模型为Y=0.69PC1+0.31PC2(PC1和PC2分别代表第一主成分和第二主成分的线性模型)。从载荷图上可以看出各生化成分分散在4个不同的象限内，说明采用的5个变量相互之间的信息重叠较少，具有代表性。从图4可以看出，HJJ-12、HJJ-1、HJJ-7、HJJ-11和HJJ-17这5份单株的评价结果比黄金菊好，HJJ-9和HJJ-14比黄金菊差，说明HJJ-12、HJJ-1、HJJ-7、HJJ-11和HJJ-17这5份单株的表型与生化品质均较好，可以进一步进行扦插繁育，形成系列新品系。江新凤等[5]的研究表明，黄金菊适合制作绿茶。通过各单株的酚氨比可以初步判断其适制性，黄金菊的酚氨比为6.51，所筛选的这5份单株的酚氨比均在5.2以下，初步判断均适合制作绿茶。HJJ-12的特征为芽叶绿色，生长势强，物候期早，游离氨基酸含量高，茶多酚含量低；HJJ-1的特征为芽叶深绿色，生长势强，物候期早，咖啡碱含量低；HJJ-7的特征为芽叶黄色，生长势中，物候期中，茶多酚含量低；HJJ-11的特征为芽叶黄色，生长势中等，物候期早，酚氨比低；HJJ-17的特征为芽叶紫色，生长势中等，物候期中，水浸出物含量高。

3 结论

17份黄金菊自然杂交单株的表型性状中树型与树姿无变异，也无多样性，其他表型性状变异较大且多样性丰富，其中以芽叶色泽、芽叶茸毛、物候期、生长势和部分叶片性状的变异较大。筛选出7份表型优良单株，其生化成分中咖啡碱含量无显著差异，其他成分差异显著；与黄金菊相比，部分自然杂交单株的游离氨基酸和简单儿茶素含量显著提升，而茶多酚、总儿茶素、酯型儿茶素含量显著下降。最终筛选出了5份表型与生化品质较好的单株，初步判断它们均适合制作绿茶，各单株具有典型特征；其中，HJJ-12和HJJ-1芽叶为绿色，HJJ-7和HJJ-11芽叶为黄色，HJJ-17芽叶为紫色。特异性(芽叶颜色、功能成分等)茶树资源发掘是茶树品种选育工作的重点，通过对黄化品种黄金菊自然杂交后代的表型变异与多样性的研究，能够初步看到变异茶树品种经过杂交之后，能够产生更加多样化的种质，所以以变异的白化、黄化、红芽和紫芽等特异品种为亲本进行杂交，可以作为一种种质创新的途径。另外，本研究仅对表型性状和部分生化成分进行了鉴定，产生表型变异和多样性的原因之一为功能基因的表达差异，进一步的研究将集中在探索其产生变异的分子机理。