混合解烃菌群对石油污染土壤生物修复的研究

张晨　杨松　王思瑶　王乙羽　杜孟哲　李玉玺　王君

摘 要：为在实验室条件下模拟混合解烃菌群对石油污染土壤的修复过程，将实验室保藏的3株解烃菌XB、JH、LJ-5活化，采用称重法测定土壤含油率，并对菌株的形态特征、乳化结果、石油降解率进行分析。结果表明，分别接种3种菌株LJ-5、XB、JH的锥形瓶中液蜡被乳化，且乳化程度较高;接入解烃菌XB、JH、LJ-5混合菌液的污染土壤菌落数在第20天达到最大值，为3.31×104cuf/g土壤;石油降解率从第15天至第25天变化最显著，到第35天趋于稳定，高达75%。试验结果为生物降解石油、利用混合菌株降低环境中的石油类污染物含量提供了理论依据。

关键词：解烃菌;石油污染土壤;生物修复

中图分类号 X172;X741 文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）03-0017-03

Bioremediation of Petroleum Contaminated Soil by Mixed Hydrocarbon Decomposing Bacteria

ZHANG Chen et al.

（College of Biological and Environmental Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， China）

Abstract： In order to study the remediation process of petroleum contaminated soil with mixed hydrocarbon decomposing bacteria under laboratory conditions. Three hydrocarbon decomposing bacteria XB， JH and LJ-5 stored in the laboratory were activated and the oil content of soil was determined by weighing method. The morphological characteristics， emulsification results and oil degradation rate of the strains were further studied and analyzed. The results showed that the liquid wax was emulsified in the conical flasks inoculated with three strains LJ-5， XB and JH respectively， and the emulsification degree was high. When the mixed liquid of hydrocarbon decomposing bacteria XB， JH and LJ-5 was added into the contaminated soil， the colony number reached the maximum value of 3.31×104cuf/g soil at the 20th day， and the oil degradation rate changed most significantly from the 15th day to the 25th day， and the oil degradation rate tended to be stable at the 35th day The hydrolysis rate is as high as 75%， which provides a theoretical basis for biodegradation of petroleum and the use of mixed strains to reduce the content of petroleum pollutants in the environment.

Key words： Hydrocarbon decomposing bacteria; Petroleum contaminated soil; Bioremediation

石油能夠给人们带来巨大的经济利益，但同时也对生态环境造成了巨大的破坏。在石油的开采、冶炼、运输、使用以及处理过程中，遗漏、井喷和输油管道泄漏等事故时常发生，造成严重的土壤污染，对环境和人类健康构成极大的威胁[1]。因此，石油工业发展所带来的环境问题日益受到重视[2]。对石油污染土壤的处理方法主要有生物法、化学法和物理法3种。化学法和物理法费用昂贵，且可能导致二次污染，一般仅作为生物方法的辅助手段[3]。生物修复是指利用微生物及其他生物，将土壤中的石油污染物降解成CO2和H2O，或转化成无害物质的工程技术[4]，具有处理效果好、处理费用低并能避免二次污染等优势。利用微生物修复石油污染土壤在环境科学界被广泛认可，并认为具有很大的发展前景[5]。利用多元细菌培养技术，以序列信息为指导，用富集培养、直接培养和特殊培养3种方法，从水样中分离出3株高温解烃菌，对原油的降解率、降粘率较高，能有效降低原油的凝固点，具备提高石油采收率的潜力[6]。笔者应用实验室筛选保藏的解烃菌XB、JH和LJ-5对石油污染土壤进行生物修复，培养过程中定期取样，用称重法测定土壤含油率，研究实验室条件下混合解烃菌群对石油污染土壤的修复过程，以期为利用微生物进行石油污染土壤修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 取滨州学院黄河三角洲生态中心温室附近的表层土壤为土壤样品。原油由滨州油田提供。LB培养基：酵母浸出膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.2。MSM培养基：Na2HPO4 1.5g，K2HPO4 3.48g，MgSO4 0.7g，（NH4）2SO4 4g，酵母粉0.01g，液蜡2%，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 石油污染土壤样品的制备 将采集的土壤样品过100目筛，按2%原油添加量称取原油溶于石油醚中，将石油醚溶液均匀洒在已过筛的土壤样品中，搅拌混匀后置于通风橱中，待石油醚完全挥发干净后备用。

1.2.2 解烃菌的驯化 将实验室保藏的解烃菌XB、JH和LJ-5活化后，在100mL LB液体培养基中培养16h，以10%的接种量接种到100mL MSM培养基中，37℃条件下往复振荡，培养5d，反复驯化3次。

1.2.3 解烃菌的形态学鉴定 将3株解烃菌XB、JH和LJ-5用划线平板法分别接种到LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养48h，观察单菌落的菌体形态和颜色特征。

1.2.4 解烃菌的乳化实验 将XB、JH和LJ-5菌液分别取1mL接种到100mL LB液体培养基中，10h后取10mL接种到含2%液蜡的100mL MSM培养基中，37℃条件下往复振荡。3d后吸取10mL再次接种到含2%液蜡的100mL MSM培养基中，培养3d，观察乳化情况。

1.2.5 土壤中菌落计数 称取待测土样各10g，放入盛有90mL无菌水并带玻璃珠的三角烧瓶中，高速振摇约20min使土样与水充分混合，使细胞分散。用1000μL移液枪吸取1mL土壤悬液加入装有9mL无菌水的试管（规格15mm×150mm）中，充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制10-2、10-3、10-4、10-5土壤悬液，以此达到对土壤样品进行梯度稀释的目的。取100μL土壤稀释液涂布到LB固体平板上，将涂布好的平板倒置于生化培养箱中37℃培养48h后计数。

1.2.6 石油降解率的测定 （1）菌液的制备：先用LB培养基制备XB、JH和LJ-5菌株的菌悬液，然后按照1%的接种量将菌悬液分别倒入MSM培养基中进行扩大培养，培养温度设置为37℃，转速为150r/min，培养24h。（2）混合菌液的制备：从扩大培养的MSM培养基中分别量取XB、JH和LJ-5菌液液各100mL，加入到500mL的锥形瓶中充分混匀，得到3株解烃菌的混合菌液，制备3份，分别标记为1、2、3。（3）石油污染土壤的处理：分别称取1kg石油污染土样分装在编号为A、B、C、D、E的5个花盆中，再从1、2、3号锥形瓶中各量取200mL XB、JH和LJ-5的混合菌液，对应加入到A、B、C 3个花盆中，向D和E花盆中各加入200mL无菌水。A、B、C花盆為实验组，C和D花盆为对照组。将处理好的A、B、C、D、E 5个花盆置于室温下进行培养实验，每隔2d翻动土壤1次并补充水分，充分搅拌，使样品湿度保持在20%左右。每隔5d取样1次，所取样品保藏于4℃冰箱中备用。

1.2.7 土壤含油率的测定 称取A、B、C、D、E 5个花盆中的土样各10g，分别加入到5个100mL的锥形瓶中，再加入10mL石油醚，使土壤充分溶解于石油醚中。静置后将上清液吸出，转入到已烘至恒重的100mL小烧杯中，即可得到溶有石油的石油醚溶液。将小烧杯放入65℃烘箱中烘干称重。带有已烘干石油的小烧杯重量记为Ma，烘至恒重的小烧杯重量为Mb，依据公式计算石油降解率。

2 结果与分析

2.1 解烃菌的形态特征 对解烃菌XB、JH和LJ-5的菌落特征进行观察，如图1所示。由图1可知，菌株XB菌落较小，表面干燥，圆形，扁平，不透明，边缘整齐，颜色为白色;菌株JH菌落中等，表面湿润，圆形，凸起，不透明，边缘整齐，颜色为橘黄色;菌株LJ-5菌落中等，表面湿润，圆形，扁平，半透明，边缘整齐，颜色为乳白色。

2.2 菌株的乳化程度 将菌株XB、JH和LJ-5分别接种到相同含量的液蜡培养基中，根据液蜡的乳化程度来评价解烃菌的驯化结果。由图2可知，接种了菌株的3个锥形瓶中的液蜡被乳化，且乳化程度较高，说明3株解烃菌的驯化结果较好。

2.3 土壤中的菌落数 由图3可知，在微生物处理石油污染土壤过程中，土样中微生物总菌数在第20天达到最高值，为3.31×104cuf/g土壤。

2.4 解烃菌株对石油降解率的影响 由图4可知，在石油污染土壤的生物修复过程中，接入解烃菌XB、JH和LJ-5混合菌液的实验组中石油降解率从第15天至第25天变化最为显著，到第35天趋于稳定，土样中石油降解率高达75%。由此可见，解烃菌XB、JH和LJ-5混合菌群解烃效果较好，可进一步用于石油污染土壤生物修复的现场试验。

3 结论与讨论

试验结果表明，解烃菌XB、JH和LJ-5在液蜡中驯化时对液蜡乳化程度较高，具有优良的解烃能力;接入解烃菌XB、JH和LJ-5混合菌液的污染土壤中，菌落数在第20天达到最大值，为3.31×104cuf/g土壤;石油降解效果从第15天至第25天变化最显著，到第35天趋于稳定，高达75%;对菌落进行形态学观察发现，接入的外源菌XB、JH和LJ-5在该修复过程中一直属优势菌，在石油污染土壤的生物修复中具有很好的应用前景。本试验在实验室条件下模拟混合解烃菌群对石油污染土壤的修复并取得了良好的效果，但在实际应用中还需考虑天气以及N、P等营养物质的补充等对石油降解的影响。

参考文献

[1]Escalante EE，Gallegos MME，Favelar TE.Improvement of the hydrocarbon phytoremediation rate by Cyperuslaxus Lam. Inoculated with a microbial consortium in a model system[J]. Chemosphere，2005，59（3）：405-413.

[2]Li CR， Wang WK， Cao YQ. Petroleum pollutions degraded by microorganisms [J].Journal of Earth Sciences and Environment，2007，29（2）：214-216.

[3]齐永强，王红旗，刘敬奇.土壤中石油污染物微生物降解及其降解去向[J].中国工程科学，2003，5（8）：70-75.

[4]张子间，张立辉，刘勇弟，等.微生物降解石油烃污染物的研究进展[J].化工环保，2009，29（3）：193-198.

[5]丁爱芳.生物技术在污染土壤修复中的应用[J].安徽农学通报，2008，14（23）：79-80.

[6]王君，马挺，刘静，等.利用PCR-DGGE技术指导高温油藏中功能微生物的分离[J].环境科学，2008，29（2）：462-468.

[7]李习武，刘志培.石油烃类的微生物降解[J].微生物学报，2002，42（6）764-767.

[8]Marx MC，Wood M，Jarvis SC.A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils[J]. Soil Biology & Biochemistry，2001，33（12-13）：1633-1640. （责编：徐世红）

基金项目：全国大学生创新训练计划（201810449019）。

作者简介：张晨（2000—），女，山东滨州人，在读本科，研究方向：微生物的分离与应用。 *通讯作者  收稿日期：2021-01-06