草鱼体表粘液凝集素制备及其性质研究

刘帅　董毓卿　岳福鹏　张树民　李伟

摘 要：以草鱼体表粘液凝集素为研究对象，经PBS提取粗提物后，通过离子交换层析DEAE-52对该凝集素进行初步纯化，得到一种具有凝集鸡血细胞的凝集素。该凝集素在20～40℃及pH 7～8条件下表现出较好的凝集活性，且凝集活性不依赖Ca2+的存在。依据凝血活性糖抑制试验结果，推测草鱼体表粘液凝集素可能为半乳糖结合凝集素。

关键词：草鱼;体表粘液;凝集素

中图分类号 Q26;Q959.4文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）03-0009-03

Study on Preparation and Characterization of Lectin from Surface Mucus of Ctenopharyngodon idellus

LIU Shuai1 et al.

（1School of Agriculture， Hetao College， Bayannur 015000， China）

Abstract： The lectin from surface mucus of Ctenopharyngodon idellus was extracted by PBS and purified by ion exchange chromatography with DEAE-52 to obtain a lectin with agglutinated chicken blood cells.The lectin exhibited good agglutination activity at 20～40℃ and pH 7～8， and the agglutination activity of the lectin was independent of the presence of Ca2+. Based on the results of coagulation active sugar inhibition test， it was speculated that the mucus lectin of Ctenopharyngodon idellus might be galactose-binding lectin.

Key words： Ctenopharyngodon idellus; Surface mucus; Lectin

鱼类体表粘液是由其皮肤腺细胞分泌的，含有多糖、蛋白质和纤维类等多种物质。多项研究表明，鱼类体表粘液具有免疫学功能，在鱼类先天性免疫中发挥着非常重要的作用[1，2]。鱼类的先天免疫因子包括溶菌酶、抗菌肽、模式识别受体、补体、细胞因子、凝集素及转铁蛋白等[3-5]。其中，凝集素因其特异性的识别功能，近年来已逐渐成为学者的重点研究对象。

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国四大淡水鱼之一，营养丰富，价格低廉，深受消费者青睐。近年来，随着养殖规模的扩大以及水体环境污染和集约化养殖模式的发展，草鱼的生存环境面临多重威胁。笔者在研究鱼类免疫机制过程中，发现对草鱼凝集素的研究大多集中在草鱼血清凝集素，而对于草鱼体表粘液凝集素的研究尚未见报道。为此，笔者从草鱼体表粘液中发现一种天然凝集素，并对其部分理化性质及生物学性质进行了研究，以进一步明确草鱼免疫机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料 2～3龄草鱼，购于巴彦淖尔市车站市场;鸡血细胞购自河南一祺生物技术有限公司。供试试剂包括：Cellulose DE 52（英国Whatman公司产品）;D-葡萄糖、水苏糖、D-海藻糖、D-山梨糖醇、D-蜜三糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖（均为RuiBio公司产品）;猪胃黏蛋白（合肥博美生物科技有限公司）;其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 草鱼体表粘液采集 取混有体表粘液草鱼鳞片，按1∶3（w∶v）分别加入TBS（pH 7.2，0.01mol/L）、PBS（pH 7.2，0.01mol/L）、生理盐水（0.09% NaCl）及蒸馏水中，浸泡过夜。4000r/min离心15min取上清液，测定凝血活力后，冻干得到草鱼粘液粗提物，4℃保存备用。

1.2.2 草鱼体表粘液凝集素凝血活力测定 取样品溶液25μL于96孔U型凝血板中，依次进行连续倍比稀释，稀释液为PBS（pH 7.2，0.01mol/L）缓冲液，然后每孔再分别加入用TBS（pH7.2，0.01mol/L）缓冲液稀释至2%鸡血细胞，静置2h观察凝集现象。凝血活力以产生凝集现象最大稀释倍数的倒数表示（以2n表示）[6]。

1.2.3 草鱼体表粘液凝集素的制备 使用DEAE-52对草鱼体表粘液凝集素进行分离。将草鱼粘液粗提物溶于0.01mol/L Tris-HCl，得到浓度为5mg/mL样液，层析柱（预装柱规格为φ16mm×300mm）上样量为2mL，以1mL/min的速度通过自动部分收集器对洗脱液进行收集。采用梯度洗脱，前30管NaCl浓度为0mol/L，从第31～120管NaCl浓度为0～1mol/L，每管收集3mL，分别在280nm处测定各管吸光度值，绘制洗脱曲线，并收集具有凝血活性的组分。

1.2.4 糖抑制试验 分别配置浓度为0.05mg/mL的D-葡萄糖、水苏糖、D-海藻糖、D-山梨糖醇、D-蜜三糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖、猪胃黏蛋白溶液。参照1.2.2方法，再加入2%血细胞前，每孔加入25μL上述糖溶液，静置2h，觀察并记录结果。

1.2.5 pH对凝集活性的影响 将分离出草鱼体表粘液凝集素冻干粉分别溶于pH 3～11的缓冲液中，测定凝血活性。其中：pH 3～5为磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液，pH 6～7为磷酸盐缓冲液，pH 8为Tris-HCl缓冲液，pH 9～10为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 11为氢氧化钠溶液。

1.2.6 溫度及时间对凝集活性的影响 将分离出的草鱼体表粘液凝集素置于30、40、50、60、70℃各1h，并分别在1h内的第5、10、20、30、40、50、60min取样，测定其凝血活性。

2 结果与分析

2.1 不同提取液对草鱼体表粘液凝集素提取的影响 由表1可知，生理盐水（0.09% NaCl）和蒸馏水作为草鱼体表粘液凝集素提取溶剂时，能够溶出一定量的凝集素，但溶出量并不显著;而PBS（pH 7.2，0.01mol/L）和TBS（pH 7.2，0.01mol/L）均能有效提高凝集素的溶出量，且PBS与其他3种提取溶剂相比，显著提高了凝集素的溶出量，这与PBS常作为溶解蛋白质类物质的缓冲溶剂性质相符。凝血活力测定实验中，分别采用PBS和TBS 2种缓冲液作为稀释液，TBS缓冲液作为稀释液时凝血活力为28，而PBS缓冲液作为稀释液时凝血活力为26，说明TBS作为稀释液能显著提高凝集素的凝血活性。此外，使用胰蛋白酶处理过的血细胞与正常使用TBS处理的血细胞的凝血活力无明显差异，并且该凝集素的凝集活性不依赖Ca2+存在，因此后续试验中使用的倍比稀释液均为TBS缓冲液。

2.2 草鱼体表粘液凝集素的分离 将冻干后的草鱼体表粘液粗提物用PBS溶解后，过DEAE-52离子交换层析柱，测定自动部分收集器收集各试管在280nm处的吸光度值所绘制洗脱曲线如图1所示。由图1可知，共得到3个吸收峰，经测定发现第2个峰具有较好的凝血活性，其他部分凝血活性较低或无凝血活性。合并、透析、冻干具有凝血活性的蛋白峰，后期可通过体积排阻色谱及高效液相色谱进行进一步纯化。

2.3 糖和糖蛋白对草鱼体表粘液凝集素活性的影响 能够以非共价键与糖或糖蛋白特异性结合，无论是单糖、寡糖还是多糖都可能对凝集素的凝集活性产生抑制作用，因此研究凝集素的糖抑制性非常必要[7]。由表2可知，草鱼体表粘液凝集素的凝血活性受到D-蜜三糖、D-半乳糖和猪胃黏蛋白的抑制，其最小抑制浓度分别为3.13、0.39、0.39μg/mL。蜜三糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，说明草鱼体表粘液凝集素可能为半乳糖结合凝集素;而猪胃黏蛋白对草鱼体表粘液凝集素的凝血活性也有很强的抑制作用，说明猪胃黏蛋白上的糖链结构与草鱼体表粘液凝集素结合位点的结构域高度互补。

2.4 pH对草鱼体表粘液凝集素活性的影响 不同pH对草鱼体表粘液凝集素凝血活力影响的试验结果如表3所示。由表3可知，pH在3～4时，草鱼体表粘液凝集素无凝血活力;pH在5～7时，凝血活力随pH升高而急剧增高，表明酸性条件能够影响凝集素糖结合域（CRD）的位置，从而降低凝集素的凝血活性[8];pH在7～8时，凝集素的凝血活力达到最大（28）;pH在9～11时，凝集素凝血活性随pH的增加而缓慢降低，表明OH-可能会改变凝集素电离状态，从而降低了凝集素的凝血活性[9]。

2.5 温度及时间对凝集活性的影响 不同温度及时间对草鱼体表粘液凝集素活性的影响试验结果如表4所示。由表4可知，草鱼体表粘液凝集素在常温下（24℃）和30℃时，凝血活力最高（28），且随时间增加，凝血活力变化明显。当温度升高后，凝集素的凝血活力随温度及时间的增加而明显降低。在40℃热处理条件下，30min后，凝集素的凝血活力下降了25%;在50℃热处理条件下，20min内凝集素的凝血活力显著下降，到30min时凝集素开始失活;在60℃热处理条件下，5min后凝集素开始失活;而70℃时凝集素完全失活。由此可见，凝集素的凝血活性与处理温度和时间不具有线性关系，而是会在温度或时间超过某一值时突然下降。

3 结论与讨论

鱼类凝集素是鱼类先天免疫的重要组成部分，在鱼体免疫方面发挥着重要作用。鱼类的先天免疫因子包括溶菌酶、抗菌肽、模式识别受体、补体、细胞因子、凝集素及转铁蛋白等。其中，凝集素因其特异性的识别功能，近年来逐渐成为学者们的重点研究对象。

本研究以草鱼体表粘液凝集素为研究对象，经PBS提取粗提物后，通过离子交换层析DEAE-52对该凝集素进行初步纯化，得到一种具有凝集鸡血细胞的凝集素。该凝集素在20～40℃及pH 7～8条件下表现出较好的凝集活性，且该凝集素的凝集活性不依赖Ca2+的存在。依据凝血活性糖抑制试验结果，推测草鱼体表粘液凝集素可能为半乳糖结合凝集素。

鱼类凝集素成员种类繁多，几乎具有复杂的凝集素家族所有组成成分，各类凝集素还具有多种亚型，在鱼体免疫方面发挥着重要作用。近年来，随着生物技术的发展，不断有新的鱼类凝集素被发现，但其作用的分子机制尚不十分清楚。因此，鱼类凝集素的深入研究，对提高鱼类免疫及鱼病防控等方面具有重要的指导意义。

参考文献

[1]LemaitreiC，Orange N，Sagli P，et al.Characterization and ion channel activities of novel antibacterial proteins from the skin mucosa of carp（Cyprinus carpio）[J].Eur J Biochem，1996，240：143-149.

[2]Ottesen OH，Olafsen JA.On togenetic development and composition of the mucous cells and the occurrence of saccular cells in the epidermis of Atlantichalibut[J]. J Fish Biol， 1997， 50：620-633.

[3]Hasan I， Kabir S R， Haque M A， et al. Biochemical analysis and physicochemicalstability of a partially purified lectin from hilsha eggs[J]. J. Biol. Sci， 2009，17：35-40.

[4]Yousif A N，Albrigh L J，Evelyn T P T.Occurrence of lysozyme in the eggs of coho salmonOncorhynchus kisutch[J].Disease of Aquatic Organisms， 1991，10：45-49.

[5]Wang Z，Zhang S.The role of lysozyme and complement in the antibacterial activity ofzebrafish （Danio rerio） egg cytosol[J].Fish Shellfish Immunol， 2010，29 （5）：773-777.

[6]孙册，朱政，莫庆汉，等.凝集素[M].北京：科学出版社，1986.

[7]Reddy GB，Bharadwaj S，Surolia A.Thermal stability and mode of oligomerization of the tetrameric peanut agglutinin：a differential scanning calorimetry study[J].Biochemistry，1999，38（14）：4464-4470.

[8]Kawagishi H，Mori H.Chemical modification and NMR studies on a mushroomlectin Ischnoderma resinosum agglutinin （IRA）[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Protein Structure and Molecular Enzymology， 1991，1076：179-186.

[9]Gong M，An J，L?HZ， et al.Effects of denaturation and amino Acid modificationon fluorescence spectrum and hemagglutinating activity of hericium erinaceumLectin[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 2004， 36（5）：343-350.

（責编：徐世红）

基金项目：2017年河套学院自然科学研究一般项目（HYZQ201716）。

作者简介：刘帅（1982—），男，内蒙古巴彦淖尔人，讲师，从事食品生物活性物质研究工作。  收稿日期：2021-01-03