miR-29a对MPP+诱导PC12细胞凋亡影响及机制

(河南大学第一附属医院老年神经内科,河南 郑州 475000)

帕金森病(PD)是一种多发于中老年的慢性神经退行性疾病[1]。研究表明，PD的病理进展与细胞氧化应激[2]、凋亡率增加[3]、线粒体功能障碍[4]等紧密相关。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为18～25 nt的短链小RNA，目前已被证实在人类多种疾病包括PD的发生发展中发挥重要的调控作用[5-7]。研究表明，miR-29a在PD病人血浆中表达量明显减少[8-10]，表明miR-29a可能参与PD的发生发展和恶化过程。然而，miR-29a在PD中的作用及其具体的作用机制尚不明确。因此，本文通过1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞构建PD细胞模型，观察miR-29a对细胞中活性氧(ROS)以及凋亡率的影响，为阐明PD发病的病理机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PC12细胞由北纳生物公司提供，胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；MPP+、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和噻唑蓝比色法(MTT)试剂购自美国Sigma公司；Trizol试剂、PCR逆转录试剂盒、荧光定量PCR(qPCR)试剂盒、荧光素酶试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；Lipofectamine 2000购自美国Life Technologies公司；对照质粒、anti-miR-29a质粒(5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′)均购自广州锐博生物科技公司。7500荧光定量 PCR 仪购自美国ABI公司，荧光显微镜购自日本OLYMBUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养方法以及模型构建 将PC12细胞培养在含体积分数0.10胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基中，培养条件设为体积分数0.05 CO2、37 ℃，待细胞生长达到90%融合时加入胰蛋白酶按1∶3传代。取对数期的PC12细胞以5×105个接种到6孔板中，过夜分别培养，加入终浓度为0、100、300、500 μmol/L的MPP+，放置在37 ℃培养箱继续培养24 h。

1.2.2qPCR实验 收集PC12细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书操作，合成cDNA。以cDNA为模板，由上海生工生物技术公司设计、合成miR-29a和U6引物(见表1)，进行qPCR扩增实验。以U6作为参照。反应条件：95 ℃、8 min；95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，35个循环。使用2-ΔΔCt法计算miR-29a 的相对表达量。

表1 qPCR扩增引物及其序列

1.2.3MTT实验 分别向不同浓度MPP+溶液孵育24 h后的PC12细胞中添加100 μL MTT溶液(500 mg/L)，37 ℃孵育4 h，除去MTT溶液，再加入150 μL二甲基亚砜，反应10 min，使用酶标仪测定490 nm波长处吸光度值(A)，计算各组PC12细胞的存活率，细胞存活率(%)=(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)×100%。

1.2.4细胞的转染 选取对数期PC12细胞，根据前期实验结果随机分为4组：0 μmol/L MPP++anti-NC组(A组)、0 μmol/L MPP++anti-miR-29a组(B组)、500 μmol/L MPP++anti-NC组(C组)、500 μmol/L MPP++anti-miR-29a组(D组)。A组、B组PC12细胞中加入0 μmol/L的 MPP+孵育24 h，并在Lipofectamine 2000介导下分别转染对照质粒和anti-miR-29a质粒。C组、D组PC12细胞中分别加入500 μmol/L 的MPP+孵育24 h后，再分别转染入对照质粒和anti-miR-29a质粒。继续培养48 h。

1.2.5细胞ROS的检测 收集各组PC12细胞接种至24孔板中，每孔加入10 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃孵育30 min。荧光显微镜下随机选取5个视野分析平均绿色荧光强度。

1.2.6流式细胞术实验 收集细胞，用PBS冲洗3次，调整细胞密度至1×109/L。根据细胞凋亡试剂盒说明书，在室温下每孔分别加入膜联蛋白 V-FITC和碘化丙啶各5 μL，混合均匀，孵育15 min。采用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验 用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)软件预测miR-29a与重组人转化生长因子诱导因子同源框2(TGIF2)基因的靶向关系，荧光素酶进一步验证。野生型(TGIF2-wt)荧光素酶报告载体(含有与miR-29a结合位点)以及突变位型(TGIF2-mut)荧光素酶报告载体均购买自广州锐博生物科技公司。将TGIF2-wt和TGIF2-mut分别与对照质粒以及anti-miR-29a质粒共转染入PC12细胞，37 ℃培养48 h，采用荧光素酶试剂盒测定PC12细胞相对荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度MPP+对PC12细胞miR-29a表达量及细胞活力的影响

与0 μmol/L相比较，100、300、500 μmol/L 的MPP+诱导PC12细胞中miR-29a的表达量显著上升，差异具有统计学意义(F=590.067，P<0.05)，PC12细胞存活率明显降低，差异具有统计学意义(F=153.561，P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度MPP+对PC12细胞miR-29a表达量及细胞活力影响

与A组相比，B组细胞中miR-29a的表达量明显降低，C组、D组细胞中miR-29a的表达量明显增加，差异具有统计学意义(F=574.765，q=8.106～45.723，P<0.05)；与C组相比，D组PC12细胞中miR-29a的表达量明显降低，差异具有统计学意义(q=40.457，P<0.05)。见表3。

表3 转染anti-miR-29a质粒对miR-29a表达、ROS和凋亡影响

2.3 下调miR-29a对细胞ROS、凋亡的影响

与A组相比较，B组PC12细胞中ROS水平、细胞凋亡率无显著差异， C组、D组PC12细胞中ROS水平、凋亡率明显增加(F=254.120、301.044，q=7.076～36.233，P<0.05)；与C组相比较，D组ROS的水平、凋亡率显著降低，差异均具有显著性(q=13.629、26.247，P<0.05)。见图1和表3。

A：0 μmol/L MPP++anti-NC，B：0 μmol/L MPP++anti-miR-29a，C：500 μmol/L MPP++anti-NC，D：500 μmol/L MPP++anti-miR-29a。

2.4 miR-29a靶基因的预测和验证

TGIF2基因3′端非翻译区域与miR-29a靶向结合；与anti-NC与TGIF2-wt共转染相比，anti-miR-29a与TGIF2-wt共转染提高PC12细胞荧光素酶相对活性(t=21.266，P<0.05)；但anti-miR-29a与TGIF2-mut共转染对PC12细胞荧光素酶相对活性无明显影响。见图2和表4。

图2 TargetScan预测miR-29a与TGIF2靶向关系

表4 miR-29a与TGIF2靶向关系的验证

3 讨 论

PD是一种运动障碍性疾病，随着年龄的增加患病风险增加，严重影响老年人的身体健康。研究表明，细胞凋亡在PD发生、恶化过程中具有重要作用[11-12]。研究证实，miRNA参与神经退行性疾病的发生发展，影响神经细胞的分化、凋亡等，从而影响病人的病理进程[13]。miRNA在PD病人中的表达量显著异常，表明miRNA可能在PD的病理演进过程中发挥重要的作用[14-16]。研究表明，miR-29a表达量异常在人类多种疾病中发挥重要作用，如结直肠癌、胰腺癌、胃癌、子宫内膜癌等[17-20]。邱峰等[21]通过μParaflo®微流体芯片技术发现，miR-29a在PD病人表达量明显上调。韩凯等[5]的研究也进一步证实，miR-29a在PD病人外周血清中表达量较对照组明显增加，可作为PD临床诊断的潜在新血清标志物。但miR-29a在PD发生发展过程中的具体作用尚不清楚。

目前，采用MPP+诱导PC12细胞构建PD细胞模型是国内外公认的研究模型[22-23]。本文研究结果显示，miR-29a表达量随着MPP+浓度的增加逐渐升高，表明miR-29a可能参与PD的发生发展过程。MPP+浓度越高，miR-29a的表达量越高，其中浓度为500 μmol/L的MPP+诱导PC12细胞的存活率为(45.674±3.152)%，因此选择500 μmol/L的MPP+作为后续实验干预浓度。此外，本实验结果还显示，转染anti-miR-29a质粒可明显降低PC12细胞中miR-29a的表达量，表明转染成功，可用于后续实验。本文进一步研究显示，抑制miR-29a的表达量可降低PC12细胞中ROS水平以及凋亡率，表明抑制miR-29a表达可能通过影响细胞的氧化应激水平和凋亡率，从而参与PD的病理进展。

miRNA主要通过靶向阻碍下游靶基因的转录或翻译，调控细胞的生物学特性，从而抑制或诱导疾病的病理进程[24]。TGIF2蛋白是三胺酸环延伸(TALE)蛋白家族成员之一，参与多种肿瘤如胶质瘤、前列腺癌、胃癌等的发生发展过程，对细胞的增殖、凋亡具有重要的调控作用[25-28]。TGIF2对胶质瘤和胶质瘤干细胞同样具有调控作用[29-33]。此外，TGIF2能够参与神经干细胞的调控，在调节神经系统发育中扮演重要角色。因此，推测TGIF2对神经细胞PC12的凋亡可能存在一定的调控作用[34-36]。在本实验中，在线预测显示miR-29a与TGIF2存在靶向结合位点，表明TGIF2可能是miR-29a的下游靶基因。双荧光素酶进一步验证表明，下调miR-29a与野生型TGIF2荧光素酶报告载体共转染可显著增加PC12细胞的荧光素酶活性，而与突变型TGIF2荧光素酶报告载体共转染对PC12细胞荧光素酶活性无显著影响，证实TGIF2是miR-29a的下游靶基因，表明miR-29a可能通过靶向TGIF2抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡和氧化应激反应，从而阻碍PD的进一步恶化。

综上所述，miR-29a在MPP+诱导的PC12细胞中表达量增加，且具有一定的浓度依赖性；下调miR-29a可能通过靶向TGIF2抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡，阻碍其氧化应激反应，这为PD基因靶向治疗提供新的方向。但本实验仅在细胞水平进行了相关研究，且本实验未涉及干扰TGIF2进行验证，本研究尚显不足，后续实验将对此进行补充。此外未来会进一步通过构建动物模型等深入探究miR-29a在PD发生发展中的作用及机制。