酶制剂对绿狐尾藻、稻秸粉与玉米粉混合青贮品质的影响

吴康乐，曹 欣，谢 展，肖润林，张志飞

（1.湖南农业大学农学院, 湖南 长沙 410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所, 湖南 长沙 410125）

绿狐尾藻（Myriophyllum elatinoides)是小二仙草科狐尾藻属多年生沉水或浮水草本植物。绿狐尾藻适应性强、生物产量大，年产鲜草600～900 t·hm-2，是畜禽污水治理中较好的生物资源[1]。绿狐尾藻茎叶脆嫩，营养价值高[2]，但绿狐尾藻饲料化利用受到含水量较高（90%左右)的制约。相较于晒（烘)制干草，绿狐尾藻与稻（Oryza sativa)秸、精料等干物质含量高的辅料混合青贮加工成青贮饲料更加适合。采用干物质含量高的玉米（Zea mays)粉或秸秆等与高水分新料混合青贮，可平衡青贮发酵时乳酸菌对水分的需求。玉米粉富含碳水化合物，常被用作与苜蓿（Medicago sativa)[3]、麻叶荨麻（Urtica cannabina)[4]等青绿饲草或马铃薯（Solanum tuberosum)淀粉渣[5]等生物资源的辅料进行混合青贮，可达到较好的发酵效果。水稻秸秆在我国产量大，易收集，价格低，在高水分青绿饲草混合青贮中添加可有效降低含水量[6]，但水稻秸秆的纤维含量较高，混合青贮会增加纤维含量。而纤维素酶可分解纤维素，木聚糖酶可降解半纤维素中的阿拉伯木聚糖，二者均能将植物细胞壁成分降解为可溶性糖，为乳酸菌发酵提供碳源，有效改善发酵品质，是常用的青贮促进剂[7-8]。

前期预备试验发现，精细粉碎后的稻秸粉较粉碎的稻秸吸水性更好，且更利于与绿狐尾藻均匀混合；质量比70% ∶ 15% ∶ 15%的绿狐尾藻、稻秸粉和玉米粉混合后可基本满足适宜青贮的含水量（65% ±5%)要求。本研究以此混合比例的青贮原料为研究对象，分别添加纤维素酶、木聚糖酶以及复合纤维素酶，旨在探究3 种酶制剂对绿狐尾藻混合青贮的营养品质、发酵品质及有氧稳定性的影响，筛选适宜青贮添加剂，为绿狐尾藻饲料化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于中国科学院农业环境监测站（28°55′36″ N，113°34′65″ E)三级绿狐尾藻表面流人工湿地的第三级湿地人工采集自然株高50 cm 左右的绿狐尾藻，粉碎至2～3 cm；稻秸粉和玉米粉为精细粉碎至1 mm 粉末。混合青贮原料为新鲜绿狐尾藻 + 稻秸粉 + 玉米粉，质量比为70% ∶ 15% ∶ 15%。青贮原料的化学成分如表1 所列。

表1 青贮原料化学成分Table 1 Chemical composition of ensilage materials

纤维素酶（50 000 U·g-1)和木聚糖酶（100 000 U·g-1)来源于罗恩试剂有限公司，复合纤维素酶（纤维素酶20 000 U·g-1+ 木聚糖酶15 000 U·g-1)来源于广州溢多利有限公司。

1.2 试验设计

本试验共4 个处理，处理1 （C1)为添加纤维素酶0.5 g·kg-1，处理2 （C2)为添加木聚糖酶0.25 g·kg-1，处理3 （C3)为添加复合纤维素酶0.71 g·kg-1，以上3 种酶分别溶解至10 mL 水中备用，处理4 为对照组（CK)添加10 mL 等量水。以上添加比例均以混合原料鲜重为基础计算。

首先在稻秸粉上分别均匀喷洒各处理组的酶制剂，对照喷洒等量水，再与一定比例的绿狐尾藻、玉米粉均匀混合。用聚乙烯袋（长40 cm，宽28 cm，厚度0.02 mm)抽真空保存，每袋500 g 左右，每处理5 次重复。避光常温保存30 d 后开包测定各项指标。

1.3 测定指标及测定方法

开包后依据德国农业协会（DLG)评分法[9]对混合青贮饲料的嗅觉、结构、色泽3 项指标进行评分，最后计算总分评价等级。

随后每处理随机取20 g 青贮鲜料，加180 mL去离子水，榨汁机（九阳JYL-C012 型多功能搅拌机)粉碎，4 层纱布过滤后得到青贮饲料浸提液，每处理3 次重复。浸提液用于测定pH、氨态氮（NH3-N)[10]、乳酸及挥发性脂肪酸含量，3 次重复。乳酸（lactic acid，LA)含量使用高效液相色谱仪（Agilent 1 260)测定（色谱柱：AcclaimTMOrganic acid （4.00 mm × 150 mm，5 μm)；进样体积：5 μL；流速：0.6 mL·min-1；柱温：30 ℃；流动相：50 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液，运行时间：10 min；检测波长210 nm)；乙酸（acetic acid，AA)、丙酸（propionic acid，PA)和丁 酸（butyric acid，BA)含量使用气相色谱仪（Agilent 7 890A)测定（色谱 柱：DB-FFAP （30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；流 速：0.8 mL·min-1；进样量：1 μL；分流比：50 ∶ 1；程序升温条件：60 ℃，保持2 min，以20 ℃升至220 ℃，保持3.5 min；检测器：氢火焰离子化检测器，温度：250 ℃)。

另取150 g 青贮饲料，105 ℃杀青15 min 后，65 ℃烘干至恒重，用于测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF)、粗蛋白质（crude protein，CP)、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC)等指标[11]，3 次重复。

依据日本草地畜产协会制定的青贮饲料发酵品质V-Score 评分标准[12]，计算V-Score 值，80 分以上良好，60～80 分尚可，60 分以下不良。

1.4 青贮饲料有氧稳定性分析

开包后取200 g 青贮料于敞口发芽盒（12 cm ×12 cm)中室温下存放，表面盖上湿纱布，防止交叉污染和减少水分损失。发芽盒中心插入电子温度计至青贮料中2～3 cm，每隔2 h 自动记录一次温度，饲料核心温度比外界温度高出2 ℃时结束试验[13]。3 次重复。以蒸馏水为空白对照。

1.5 数据分析

采用DPS 7.05 对不同处理组青贮饲料的部分发酵指标和营养指标等进行单因素LSD 多重比较。

2 结果与分析

2.1 混合青贮饲料的感官评价

从气味、结构与色泽等方面评价各酶制剂处理组的感官质量（表2)，结果发现，4 个处理组评价均达到优等，总分最高的为C2和C3（19 分)，有芳香果味或明显的面包香味；C1和CK 为16 分，有微弱的丁酸臭味，芳香味弱。4 组的茎叶结构均保持良好。C1、CK 的色泽与原料相似，呈淡褐色；C2、C3的色泽略有变色，呈淡黄色或带褐色。

表2 酶制剂对混合青贮饲料感官质量的影响Table 2 Effect of enzyme preparation on sensory evaluation of mixed silage

2.2 混合青贮饲料的发酵指标

C3的乳酸含量最高，为4.53%，显著高于C1和CK （P＜ 0.05)，C1和C2无显著差异（P ＞0.05)；C2的乙酸含量显著高于C1和CK （P＜ 0.05)；各处理均未检测到丙酸；C3未检测到丁酸，其他3 组的丁酸含量也较低，无显著差异（P＞ 0.05)；各组的V-Score 评分都在96 分以上，符合优质青贮评分范畴。C1、C2和C3的氨态氮/总氮无显著差异（P＞ 0.05)，但均显著低于CK （P＜ 0.05) （表3)。

C3的pH 显 著 低 于C1、C2和CK，其 中CK 的pH 显著高于其他处理组（P＜ 0.05)；添加剂处理组的pH 均较低，符合优质青贮pH 范畴（表3)。各处理组原料含水量在71.82%～73.73%，处理组间没有显著差异（P＞ 0.05)，原料含水量略高于常规青贮适宜含水量（60%～70%) （表3)。

表3 酶制剂对混合青贮饲料发酵品质的影响Table 3 Effect of enzyme preparation on fermentation quality of mixed silage

2.3 混合青贮饲料的营养指标及有氧稳定性

C1的CP 含量显著高于其他3 个处理组（P＜ 0.05)，CK 最低；C1的NDF 含量显著低于其他3 个处理组（P＜ 0.05)；各处理组的ADF 含量无显著差异（P＜ 0.05)；各处理的WSC 含量均较低，其中CK 显著低于其他3 个处理组（P＜ 0.05) （表4)。

表4 酶制剂对混合青贮饲料营养成分及有氧稳定的影响Table 4 Effect of enzyme preparation on nutrient composition and aerobic stability of mixed silage

C2有氧稳定性最好，达到240 h，C1有氧稳定性达到212 h，而C3和CK 的有氧稳定性较差，分别为50 h 和52 h （表4)。

3 讨论

3.1 纤维素酶制剂对青贮品质的影响

纤维素酶和木聚糖酶可降解植物细胞壁中结构性碳水化合物（纤维素或半纤维素等)，产生可溶性碳水化合物，为青贮过程中乳酸菌的繁殖提供底物。青贮饲料中添加纤维素酶和木聚糖酶等酶制剂对青贮饲料发酵品质和营养品质改善效果不尽相同，或受添加酶种类、添加量以及青贮原料种类的影响。张适等[14]在玉米秸秆青贮中分别添加10 000 U·kg-1的纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-葡聚糖酶，结果发现所有酶处理组的氨态氮/总氮显著降低（P＜ 0.05)，可溶性糖含量显著升高（P＜ 0.05)；纤维素酶处理组的粗蛋白质含量显著升高（P＜ 0.05)；β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶处理组的中性洗涤纤维含量显著低于对照组（P＜ 0.05)。叶杭等[15]发现，随着木糖酶添加量的增大，低水分（37.5%)水稻秸秆青贮饲料的pH、中性洗涤纤维含量显著下降（P＜ 0.05)；可溶性碳水化合物含量有上升趋势，但酸性洗涤纤维含量无显著影响（P＞ 0.05)。赵金鹏等[16]在添加纤维素酶处理的水稻秸秆青贮时亦发现，青贮60 d 后，与未添加的对照处理组相比，纤维素酶处理组的中性洗涤纤维含量降低幅度（39 g·kg-1)远大于酸性洗涤纤维含量降低幅度（11 g·kg-1)；且纤维素含量和半纤维素含量均显著低于未添加对照组（P＜ 0.05)。陈光吉等[17]研究发现，紫花苜蓿和皇竹草（Pennisetum sinese)为主的发酵TMR 饲料中添加纤维素酶和木聚糖酶的复合粉剂（酶活力分别为7 864.26 和3 918.47 U·kg-1)发酵49 d后，发现0.8～1.6 g·kg-1添加量制备的发酵TMR 发酵品质较好（pH 较低)；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著低于对照组（P＜ 0.05)，具有较高的纤维素酶和木聚糖酶活力，另外羧基肽酶和酸性蛋白酶活力均下降，这意味着外源纤维素酶和木聚糖酶的添加促使青贮饲料的纤维素得到分解而降低了蛋白质的损失。本研究中亦发现3 种酶处理组的pH 显著低于未添加的对照组（P＜ 0.05)；纤维素酶处理组的中性洗涤纤维含量和氨态氮/总氮显著低于对照组（P＜ 0.05)，木聚糖酶和混合纤维素酶处理组的中性洗涤纤维含量低于对照组，但没有显著差异（P＞ 0.05)；3 种酶处理组的酸性洗涤纤维含量与对照亦没有显著差异（P＞ 0.05)。乳酸菌[18]、甲酸、糖蜜[19]、纤维素酶或木聚糖酶等青贮添加剂均可降低青贮饲料中性洗涤纤维含量，但青贮添加剂对酸性洗涤纤维含量的影响不尽相同，这可能与中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的组成有关，易降解的部分以半纤维素为主。

3.2 绿狐尾藻混合青贮可行性

绿狐尾藻有发达的根状茎，在富含氮磷的水体中生长迅速，能高效去除污染的水体（含底泥)中铵态氮、硝态氮、总氮等，常用于建植三级绿狐尾藻表面流人工湿地（三层去污，逐级递进)处理养猪废水[20-21]，湿地出水优于《国家畜禽养殖污水排放标准》，本研究采用三级绿狐尾藻表面流人工湿地中第三层湿地生长的绿狐尾藻为试验材料，前人研究表明，绿狐尾藻植株体内各项离子指标均达到可饲用标准[22]。绿狐尾藻年产鲜草600～900 t·hm-2，平均折合干物质75 t·hm-2。净化水体后的大量绿狐尾藻急需资源化利用，青贮是饲料化利用的有效方法之一。孙茜等[23]添加不同的乳酸菌剂制备绿狐尾藻青贮饲料，因青贮原料含水量较高（77%)，青贮发酵30 d 后pH 在4.71～5.68，发酵品质较差。而本研究中利用玉米粉、秸秆粉与绿狐尾藻进行混合青贮，降低了青贮原料含水量，且补充了乳酸菌发酵所需的底物，在不添加纤维素酶制剂的情况，仍可获得较好的发酵品质和营养品质，而添加纤维素酶或木聚糖酶后可有效改善营养品质，并提高有氧稳定性。

本研究中纤维素酶、木聚糖酶和复合纤维素酶制剂的添加剂量参考了饲料添加剂来源公司的推荐量以及之前在紫花苜蓿（Medicago sativa)等同批酶制剂青贮添加剂量预实验的结果（剂量试验数据未发表)。从成本效益角度考虑，纤维素酶类添加剂较乳酸菌制剂费用更高，但从本研究结果来看，较乳酸菌制剂，酶制剂能更有效改善绿狐尾藻混合青贮的发酵品质和营养品质和有氧稳定性；在目前研究基础上，后期可考虑将纤维素酶与乳酸菌或糖蜜等复配添加，降低纤维素酶的添加量，增加综合经济效益。另外，还可对绿狐尾藻混合青贮的吸附料选择、添加剂选择、绿狐尾藻青贮料饲用价值评价等进行深入研究，以加快绿狐尾藻饲料化进程。

4 结论

以70%绿狐尾藻 + 15%水稻秸秆 + 15%玉米粉为原料可以制备发酵品质较好的青贮饲料；添加酶制剂可以显著降低pH 和氨态氮/总氮，提高可溶性碳水化合物含量；其中添加纤维素酶（C1)可显著提高混合青贮饲料的粗蛋白质含量（P＜ 0.05)，显著降低中性洗涤纤维含量（P＜ 0.05)，且具有较好的有氧稳定性和发酵品质，是绿狐尾藻混合青贮酶制剂添加较好的选择。