紫花苜蓿挥发性成分萃取条件优化与定性、定量分析

袁 宁，特日格乐，孙 林，贾玉山，格根图，王志军，卢 强，李宇宇，李俊峰，孙鹏波

（1.内蒙古农业大学草原资源环境学院 / 农业部饲草栽培加工与高效利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010000；2.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010000；3.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010000）

挥发性成分是一类具有低分子量、高蒸气压、低水溶性特点的化合物，在20 ℃、0.01 kPa 下能快速挥发，成为气相状态[1]。挥发性成分主要包括醇、醛、酮、酯、酸、烯烃等物质，它们是自然界动植物信息交流的重要介质，植物代谢所释放的挥发性成分不仅能够调节植物自身生长发育，而且对于抵御病虫害有着重要作用[2-4]。挥发性成分对气候变化的影响也日益明显，国外研究者认为随着亚马孙雨林面积的不断减少，雨季中异戊二烯的下降趋势明显，这可能是雨林生物量减少所致，旱季时倍半萜烯与异戊二烯的比例上升趋势明显，这表明气候变化引起的温度上升使得挥发性成分的排放量发生变化[5]。研究显示植物释放的挥发性成分能显著改善空气质量，使空气中负离子显著增加[6]。国内外学者对于挥发性成分的研究多集中在环境保护方面，植物释放的挥发性成分对于小气候的形成和环境的改善有显著作用[6]。饲用型牧草的挥发性成分是影响饲草适口性的关键因素，新鲜苜蓿干草有着浓郁的草香味，家畜的采食量高，而随着贮藏时间的延长干草因微生物的代谢作用而产生酸味、霉味等气味，导致家畜采食量明显下降。钱佳成和宋伟[7]研究发现玉米（Zea mays)籽实含水量为14%～15%，储藏温度 ＞ 25 ℃时极易霉变，含水量低的玉米籽实苯乙醇含量较高，通过香兰素、不饱和烯烃、不饱和烯醇化合物可有效判断玉米储藏状态。万立昊等[8]研究玉米霉变发现二氢-β-紫罗兰酮、榄香烯、棕榈酸、3-辛酮等的含量在玉米霉变后检出量较高且刺激性气味较重。郑云飞[9]研究发现稻谷随着储藏时间的延长醛类和酮类物质逐渐降低。由此推断储备多年的饲草适口性变差，家畜采食量降低，可能与紫花苜蓿（Medicago sativa)挥发性成分主要贡献物质的降低有关，饲草丧失了原本的草香味，家畜不喜采食，储备多年的饲草家畜采食量显著降低。因此，明晰牧草挥发性成分的变化，对于饲草安全贮藏与养殖业安全生产具有重要作用。

紫花苜蓿是豆科苜蓿属饲草作物，高蛋白、低纤维、维生素矿物质丰富、氨基酸种类齐全、饲用价值高等优势使得其在世界范围内广泛种植，随着畜牧业的发展，我国苜蓿产业的种植、收获、加工、贮藏技术也不断向着机械化、科学化、综合化发展[10-11]。如何提高苜蓿品质也成为制约产业发展的关键因素，其中苜蓿的挥发性成分是影响苜蓿适口性的关键因素。本研究采用顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联用（headspace solid phase microextraction—gas chromatography—mass spectrometry, HS—SPME—GC—MS)技术，探讨萃取温度、解析温度、萃取时间、解析时间对紫花苜蓿挥发性成分种类与含量的影响，在最佳萃取条件下对挥发性成分进行定性、定量分析，旨在为紫花苜蓿挥发性成分鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

萃取条件对挥发性成分的种类与含量有很大影响，本试验通过单因素试验探讨不同萃取温度、解析温度、萃取时间、解析时间（表1)下采用GC-MS检测出紫花苜蓿挥发性成分种类与含量的差异，以期筛选出最佳萃取条件与该条件下紫花苜蓿挥发性成分的种类与相对含量。

表1 单因素试验Table 1 Single factor test

1.2 试验材料

试验材料为2020 年6 月采自包头市九原区鑫泰农业有限公司的‘中苜三号’紫花苜蓿，干草含水量为12%，去除苜蓿干草中的杂草，0.147 mm 筛粉碎后装入自封袋内，保存在-80 ℃超低温冰箱中待用。

1.3 试验仪器

1.4 测定方法

1.4.1 紫花苜蓿挥发性成分测定前处理方法

萃取前需将萃取头在GC-MS 进样口进行老化，老化温度250 ℃，老化30 min。准确称取1.5 g 苜蓿干草样品放入20 mL 顶空瓶中，用密封胶垫和铝盖进行密封。顶空瓶放在磁力加热搅拌器上使其均匀受热，苜蓿干草中的挥发性成分可稳定快速地挥发出来，将老化后的萃取头插入顶空瓶，纤维头暴露在顶空瓶中使其充分吸附紫花苜蓿挥发性成分。吸附一段时间后，将萃取头插入GC-MS 进样口内，使载气不断将吸附到纤维头上的挥发性成分吹入GC-MS中，进行分析，每份样品重复3 次。

1.4.2 气相色谱—质谱分析条件

气相色谱—质谱条件参考Laopongsit 等[12]、李宇宇等[13]方法。色谱条件：使用HP-5MS UI 石英毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，柱初温为35 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1程序升温至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃·min-1程序升温至250 ℃，保持4 min，进样口温度为250 ℃，载气为高纯度氦气（纯度≥99.99%)，氦气流速为1 mL·min-1，柱前压为87.57 kPa，进样模式为分流，分流比为1 ∶ 20，进样方式为手动进样。质谱条件：离子源温度为230 ℃，传输线温度为280 ℃。电离方式EI 离子源，电子能量70 eV。质量扫描范围40～550 m·z-1，采集方式为全扫描方式，离子源真空度为7.2 × 10-7mTorr。

1.5 数据处理

根据NIST11 和NIST11s 数据库对紫花苜蓿挥发性成分进行定性分析，采用峰面积归一化法求各化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 萃取温度对紫花苜蓿挥发性成分种类与相对含量的影响

采用顶空固相微萃取法分析在萃取时间60 min，解析时间3 min，解析温度250 ℃，萃取温度20、40、50、70、90 ℃条件下探究紫花苜蓿挥发性成分种类和相对含量的差异（表2)。排除部分因萃取头高温分解和柱流失产生的化合物外，结果显示随着萃取温度的升高，挥发性成分的种类逐渐增加。萃取温度20 ℃下共检出7 种化合物，其中醛类化合物2 种，占总挥发物的26.01%。醇类化合物2 种，占总挥发物的32.78%。酮类化合物2 种，占总挥发物的32.07%。酯类化合物1 种，占总挥发物的9.15%。

表2 不同萃取温度下紫花苜蓿挥发性成分种类及相对含量Table 2 Variety and relative content of volatile components of alfalfa at different extraction temperatures

续表2（1)Table 2（Continued)

续表2（2)Table 2（Continued)

萃取温度90 ℃下共检出47 种挥发性成分，其中醛类化合物13 种，占总挥发物的14.08%。醇类化合物10 种，占总挥发物的11.7%。酮类化合物13种，占总挥发物的46.36%。酯类化合物6 种，占总挥发物的14.62%。酚类化合物2 种，占总挥发物的9.13%。烃类化合物1 种，占总挥发物的1.35%。杂环类化合物2 种，占总挥发物的1.01%。

随着萃取温度升高，紫花苜蓿挥发性成分的总峰面积和出峰数逐渐增加（图1)。但萃取温度超过90 ℃后，高温烘烤使紫花苜蓿失去原本鲜绿色，转变为焦褐色并伴有焦糊气味产生（图2)，因此萃取温度为90 ℃能使紫花苜蓿挥发性成分在不发生变性的情况下挥发完全。

孟导找个位子坐下，打量起坐在柜台前的来人。来客中等身材，戴着一副学究气的眼镜，一副文质彬彬的打扮。年纪大概在3 5岁以后，头发已经有些斑秃。看来和自己一样是从事脑力工作的。嗯，不过孟导自己倒是毛发浓密，坚挺地把守着象征年纪的高地。

图1 萃取温度对紫花苜蓿挥发性成分总峰面积与峰个数的影响Figure 1 Effect of extraction temperature on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

图2 不同萃取温度下紫花苜蓿的颜色变化Figure 2 Color changes of alfalfa at different extraction temperatures

2.2 萃取时间对紫花苜蓿挥发性成分种类与相对含量的影响

采用顶空固相微萃取法分析在萃取温度90 ℃，解析温度250 ℃，解析时间3 min，萃取时间40、50、60、70、80 min 条件下紫花苜蓿挥发性成分种类和相对含量的差异（表3)。排除部分因萃取头高温分解和柱流失产生的化合物外，结果显示萃取时间80 min时共检测出52 种化合物，其中醛类化合物15 种，占总挥发物的19.31%。醇类化合物12 种，占总挥发物的21.74%。 酮 类 化 合 物9 种， 占 总 挥 发 物 的37.55%。酯类化合物6 种，占总挥发物的9.41%。酚类化合物2 种，占总挥发物的0.72%。烃类化合物5 种，占总挥发物的6.17%。杂环类化合物2 种，占总挥发物的1.22%。芳香族化合物1 种，占总挥发物的3.57%。大部分化合物的保留时间在30 min 以内，醛类、醇类、酮类化合物相对含量占比达总挥发物的70%以上，是挥发物中的主要成分。不同萃取时间下检测到醛类化合物种类最多，酮类化合物的相对含量最高，其中β-紫罗兰酮为含量最多的化合物，其次为苯乙醇。

表3 不同萃取时间下紫花苜蓿挥发性成分种类及相对含量Table 3 Variety and relative content of volatile components of alfalfa under different extraction times

续表3（1)Table 3（Continued)

续表3（2)Table 3（Continued)

随着萃取时间的延长，紫花苜蓿挥发性成分总峰面积呈先增加后趋于稳定的趋势，出峰个数呈先增加后下降再增加的趋势，在萃取时间80 min 时总峰面积不再变化，出峰个数最多（图3)，因此80 min是理想的萃取时间。

图3 萃取时间对紫花苜蓿挥发性成分总峰面积与峰个数的影响Figure 3 Effect of extraction time on the total peak area and peak number of volatile components of alfalfa

2.3 解析时间对紫花苜蓿挥发性成分种类与相对含量的影响

采用顶空固相微萃取法分析在萃取时间60 min，萃取温度90 ℃，解析温度250 ℃，解析时间1、2、3、4、5 min 条件下紫花苜蓿挥发性成分种类和相对含量的差异。排除部分因萃取头高温分解和柱流失产生的化合物外，结果显示解析时间1 min时检测出42 种挥发性成分，但化合物的总峰面积较低，说明解析出化合物的含量较少。解析时间3 min时检测出41 种化合物，总峰面积达到最大。解析时间超过3 min 后挥发性成分的种类和总峰面积同时开始下降（图4)，因此解析时间3 min 可以将萃取头上大部分化合物解析下来。

图4 解析时间对紫花苜蓿挥发性成分总峰面积与峰个数的影响Figure 4 The influence of resolution time on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

解析时间1 min 时共检测出42 种化合物（表4)，其中醛类化合物11 种，占总挥发物的22.36%。醇类化合物6 种，占总挥发物的20.90%。酮类化合物14 种，占总挥发物的41.44%。酯类化合物5 种，占总挥发物的10.40%。烃类化合物2 种，占总挥发物的2.04%。杂环类化合物2 种，占总挥发物的1.34%。酚类化合物1 种，占总挥发物的0.77%。芳香族化合物1 种，占总挥发物0.78%。

表4 不同解析时间下紫花苜蓿挥发性成分种类及相对含量Table 4 Variety and relative content of alfalfa volatile components under different resolution times

续表4Table 4（Continued)

解析时间3 min 时共检测出41 种化合物（表4)。其中醛类化合物12 种，占总挥发物的22.41%。醇类化合物6 种，占总挥发物的17.94%。酮类化合物11 种，占总挥发物的41.07%。酯类化合物5 种，占总挥发物的11.95%。烃类化合物3 种，占总挥发物的1.89%。杂环类化合物2 种，占总挥发物的0.98%。酸类化合物1 种，占总化合物的0.24%。芳香族化合物1 种，占总化合物的3.48%。大部分化合物保留时间均在30 min 以内，醛类、醇类、酮类化合物的相对含量占总化合物的80%以上，醛类化合物种类较多，酮类化合物相对含量较高。其中β-紫罗兰酮、苯乙醇与二氢猕猴桃内酯的相对含量较高。

2.4 解析温度对挥发性成分种类与相对含量的影响

采用顶空固相微萃取法分析在萃取时间60 min，萃取温度90 ℃，解析时间3 min，解析温度230、240、250、260、270 ℃条件下紫花苜蓿挥发性成分种类和相对含量的差异。排除部分柱流失外，结果显示随着解析温度的升高，紫花苜蓿挥发性成分总峰面积与出峰个数先增加后减少，在250、260 ℃同时检测出55 种挥发性成分，但总峰面积在解析温度250 ℃时达到最大（图5)，因此选择解析温度250 ℃较为理想。

图5 解析温度对紫花苜蓿挥发性成分总峰面积与峰个数的影响Figure 5 Effect of resolution temperature on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

解析温度250 ℃时共检测出51 种化合物（表5)。其中醛类化合物15 种，占总挥发物的28.05%。醇类化合物10 种，占总挥发物的20.74%。酮类化合物9 种，占总挥发物的29.64%。酯类化合物3 种，占总挥发物的8.19%。烃类化合物11 种，占总挥发物的8.19%。杂环类化合物2 种，占总挥发物的1.83%。芳香类化合物1 种，占总挥发物的1.25%。解析温度250 ℃条件下化合物的种类最多，化合物的相对含量较高，大部分化合物保留时间基本在30 min 以内，醛类化合物的种类较为丰富，酮类化合物的相对含量较高。

表5 不同解析温度下紫花苜蓿挥发性成分种类及相对含量Table 5 Variety and relative content of alfalfa volatile components under different resolution temperatures

续表5（1)Table 5（Continued)

续表5（2)Table 5（Continued)

3 讨论

萃取条件对HS-SPME 的萃取能力有很大影响，白俊英等[14]、薛妍君等[15]研究表明高温有利于挥发性物质的吸附，萃取温度低，挥发性成分挥发较慢或挥发不完全，达到平衡的时间较长。因此紫花苜蓿的挥发性成分种类较少，相对含量较低；随着温度的升高，分子运动加快，更能激发萃取头对挥发性物质的快速吸附，缩短达到平衡的时间，紫花苜蓿挥发性成分的种类较为丰富，相对含量较高。萃取温度过高会破坏紫花苜蓿原有品质，导致挥发性组分发生变化。本研究表明萃取温度超过90 ℃紫花苜蓿会产生焦糊味，且丧失原本的鲜绿色，导致部分化合物高温分解变性，分析鉴定出的化合物极大可能不是紫花苜蓿原本的挥发物质，因此90 ℃为理想萃取温度，与侯佳宁等[16]研究结果一致。

顶空瓶中的样品、顶空瓶上部空间与萃取纤维三者之间达到平衡所需的时间称为萃取时间，通过加热等方式均可以缩短萃取时间[17]。萃取时间主要受样品本身的性质影响较大，不同的样品萃取时间不同。本研究显示随着萃取时间的增加挥发性成分总峰面积和出峰个数逐渐增加，到80 min 时基本稳定，与李凯等[18]的研究结果一致。

解析时间是影响萃取效果最主要的因素[13]。解析时间短，载气对萃取纤维吹扫不完全，导致样品不能完全从萃取纤维上剥离，最终影响萃取效果，若萃取时间太长，由于进样口温度达250 ℃，长时间的高温会使萃取纤维脱落，产生流失，甚至可能污染进样口与色谱柱。本研究表明解析时间3 min、解析温度250 ℃时萃取效果较好，与李宇宇等[13]的研究结果一致。

张静静等[19]研究显示3-戊酮、顺-2-戊烯醇、叶醇、4-甲基-1-戊醇、3-辛酮、2-乙基己醇、苯乙醇在紫花苜蓿中含量较高，同时作者推断可能是这几种物质相互配比后对苜蓿害虫具有吸引作用，该研究结果为苜蓿害虫防治提供了理论依据。李存满等[20]研究发现紫花苜蓿挥发油中主要以酸、醇、酮、酯类化合物为主，这与本研究结果类似。刘照娟等[21]采用同时蒸馏法分析紫花苜蓿挥发性成分，发现植醇、β-紫罗兰酮等6 种挥发性成分含量较高，这与本研究结果类似。

本研究中紫花苜蓿挥发性成分中醛类、酮类、醇类化合物的占比较高，其中β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、苯乙醇、1-辛烯-3-醇等化合物相对含量较高，对紫花苜蓿挥发性成分贡献较大。

4 结论

不同的萃取条件对紫花苜蓿挥发性成分的种类和含量有很大的影响，研究结果表明：萃取温度90 ℃、萃取时间80 min、解析温度250 ℃、解析时间3 min为最佳萃取条件。该萃取条件下紫花苜蓿中共检测出52 种化合物，包括酮类化合物9 种，占总挥发物的37.55%；醇类化合物12 种，占总挥发物的21.74%；醛类化合物15 种，占总挥发物的19.31%；酯类化合物6 种，占总挥发物的9.41%；烃类化合物5 种，占总挥发物的6.17%；芳香族化合物1 种，占总挥发物的3.57%；杂环类化合物2 种，占总挥发物的1.22%；酚类化合物2 种，占总挥发物的0.72%。其中β-紫罗兰酮含量可达到总挥发物的20%左右，反式-2-己烯醛、2-苯基乙醛、壬醛、癸醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3, 5, 5-三甲基环己-2-烯酮、胡薄荷酮等对紫花苜蓿挥发性成分贡献较大，由于醇类、酯类、烃类物质有较高的阈值，因此对紫花苜蓿挥发性成分贡献可能不大。