光照应激对雌性大鼠性激素水平和卵巢组织肿瘤坏死因子α、γ干扰素蛋白表达的影响*

周 知 黎业娟 陈 琳 王安国 阮海玲 马 宁 周 璟 涂志华

（海南省妇女儿童医学中心生殖医学中心，海口 570206）

各种应激以及压力影响始于大脑，随后影响机体组织和靶器官。应激反应通过神经、心血管、免疫和代谢系统的反应促进机体适应和生存[1]。随着现代工作时间的延长，人们对于光照的依赖也随之加强，尤其是晚上加班更是加强了光照对机体的影响，一定时长的光照压力引起大脑内分泌失调，进一步影响全身[2-3]。慢性应激会引起机体行为的改变，机体表现出形态和生理变化，但目前尚不清楚持续数月的光照应激是否会对机体尤其是生殖系统产生不可逆转的影响[4-5]。卵巢早衰是一种原发性卵巢损伤，大约影响1%的女性[6]。其最严重的症状是青春期发育不全和原发性闭经（大约50%是由于卵巢发育不全引起的），与生理性更年期的情况一样，卵巢早衰的临床特征是低水平的性腺激素（雌激素和抑制素）和高水平的促性腺激素促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH），可能导致不孕症或严重的神经、代谢、免疫或心血管机能紊乱，并导致骨质疏松症的早期发病[8]。本研究通过给予雌性大鼠不同的光照强度，探究其对大鼠性激素水平、动情周期变化以及卵巢组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）蛋白的表达的影响，以探讨不同的光照强度对于雌性大鼠生殖腺的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备与分组

通过阴道涂片实验筛选出SPF级2月龄左右的性成熟雌性SD大鼠100只，随机抽取20只作为对照组，其余80只为光照应激干预组（光照组）。对照组放置于常规环境，模拟正常昼夜节律（光照时间：黑暗时间=12 h：12 h），每日随机饮食水；光照组置于饲养室中饲养，每日为晚8点至早8点持续（2周）给予不同的强度光照，即20、40、60、100 W日光灯直射，距离约 2.5 m（20、40、60和100W对应的照度为251、502、754 和1 256 Lux），分别设为20 W组、40 W组、60 W组、100 W组，早8点至晚8点避免一切光照，放置于黑暗环境。在饲养过程中，20 W组、40 W组、60 W组各组给予相同饮水（250 mL）和食物（500 g），于固定时间观察检测大鼠的生物学表征如体质量、进食量以及饮水量等。6个月光照应激结束后，将各组大鼠麻醉，腹主动脉采血，离心取上清液以备用。取大鼠一侧卵巢包埋用以做免疫组织化学检测，另一侧卵巢用锡纸包埋后迅速放入液氮中。

1.2 ELISA 法检测各组大鼠血清中性激素水平

将大鼠血液3 000 r/min 离心 15 min，取上层血清置于洁净的EP 管中，严格按照ELISA 试剂盒说明书要求，测定大鼠血清FSH、雌二醇、LH 的水平，在酶标仪上450 nm 波长依序测量各孔吸光度（A450）值。

1.3 免疫组织化学显色检测卵巢组织TNF-α、IFN-γ蛋白的表达

切片脱蜡，PBS 洗 3次，微波炉内进行抗原修复，加H2O2处理，滴加封闭液，PBS 洗3次后滴加稀释好的TNF-α、IFN-γ 抗体（1∶100）孵育30 min，4℃过夜。滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃ 孵育 15 min。滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃ 孵育 20 min。给予辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育 25 min，显色剂显色 3～15 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察染色结果。卵巢组织标本中细胞质出现淡黄色或黄色颗粒状着色为阳性表达，采用 IPP 6.0 软件在同等条件下检测每张TNF-α 或IFN-γ组织切片中的 IFN-γ表达的积分光密度（A450）值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较用q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠动情周期变化

与对照组相比，光照组大鼠动情周期显著延长，且随着光照强度以及时间的推移动情周期延长更为显著，其中动情间期、动情前期、动情期持续时间差异无统计学意义（P＞0.05），但动情后期显著延长（P＜0.05）（表1）。

2.2 各组大鼠血清中性激素的含量变化

与对照组比较，40 W组、60 W组、100 W组大鼠血清中雌二醇含量显著降低（P＜0.05），FSH、LH 的含量显著升高（P＜0.05）（表2）。

表1 各组大鼠动情周期比较（±s，d）

表1 各组大鼠动情周期比较（±s，d）

*P＜0.05 vs 对照组

组别 动情周期 动情间期 动情前期 动情期持续时间 动情后期对照组 5.24±0.87 1.29±0.35 1.32±0.39 1.52±0.35 1.89±1.12 25 W组 6.54±1.74 1.53±0.48 1.51±0.63 1.84±0.47 2.64±1.90 40 W组 6.89±1.85 1.76±0.37 1.75±0.59 2.12±0.34 3.01±1.14 60 W组 8.14±1.27* 2.04±0.48 2.08±0.76 2.72±0.52 3.15±1.57*100 W组 10.89±1.84* 2.24±0.48 2.42±0.63 2.84±0.39 6.64±1.90*

2.3 TNF-α、IFN -γ在各组大鼠卵巢组织中的表达

TNF-α 蛋白主要在对照组大鼠卵巢细胞质中表达，少量在间质和黄体中表达；在不同光照组大鼠细胞质、黄体及间质中高表达，且随着光照强度的增强，各光照组大鼠卵巢中TNF-α 蛋白表达均上升（图1，表3），其中60 W组、100 W组大鼠与对照组大鼠比较，卵巢中TNF-α 蛋白表达较低，差异有统计学意义（P＜0.05），而25 W组、40 W组大鼠与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠激素水平的变化（±s）Tab2 Changes of hormone level in each group（±s）

表2 各组大鼠激素水平的变化（±s）Tab2 Changes of hormone level in each group（±s）

*P＜0.05 vs 对照组

组别 雌二醇（pg/mL）卵泡刺激素（mlU/mL）促黄体生成素（mlU/mL）对照组 48.21±4.85 2.34±0.67 3.72±1.13 25 W组 42.58±7.51 3.57±0.89 4.15±1.51 40 W组 38.42±6.11 4.14±0.35 4.75±0.45 60 W组 30.51±5.34* 7.19±0.59* 6.84±0.87*100 W组 21.36±4.24* 8.14±0.76* 8.72±1.17*

IFN-γ 蛋白主要在对照组大鼠卵巢细胞质中表达，少量在间质和黄体中表达；在不同光照组大鼠细胞质、黄体及间质中高表达，且随着光照增强而增多。与对照组比较，60 W组、100 W组卵巢中IFN-γ 蛋白的表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而25 W组、40 W组与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图2，表3）。

表3 各组大鼠卵巢组织TNF-α、IFN-γ 蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠卵巢组织TNF-α、IFN-γ 蛋白表达水平比较（±s）

*P＜0.05 vs 对照组

组别 n TNF-α IFN-γ对照组 20 4.26±0.49 3.48±0.61 25 W组 19 5.14±0.53 4.56±0.43 40 W组 19 5.85±0.41 4.95±0.36 60 W组 18 8.78±0.58* 7.90±0.46*100 W组 19 9.68±0.84* 9.14±0.29*

图1 TNF-α（A1～E1）和IFN-γ（A2～E2）在各组大鼠卵巢组织中的表达，免疫组织化学，×200

3 讨论

应激在一定程度下会干扰机体正常的平衡状态，机体会通过应激应答机制处理应激源（stressor）产生的刺激，以维护机体体内的动态平衡稳态[2]。长期的光照应激会在一定程度上影响大脑调控机体激素的功能，导致分泌激素水平下降，使得性腺轴（下丘脑-垂体-卵巢）负反馈调节受阻，导致垂体分泌的FSH和LH激素水平上升，其中以FSH的上升更为显著[9]。不同强度的光照强度均可引起大鼠性激素水平的改变，且随着光照强度以及时间的延长，对大鼠的影响也日益明显。不同光照强度干预组大鼠的外周血中雌二醇激素水平相比于对照组显著降低，可能的原因是不同光照强度影响下丘脑的分泌功能，从而影响垂体功能，进一步影响卵巢，造成机体性激素紊乱，影响大鼠卵池中各级卵泡的数量以及功能，造成卵巢储备功能低下，影响大鼠卵巢功能[10]。不同光照强度干预组大鼠血清FSH、LH激素水平显著高于对照组，一方面可能的原因是大鼠晚上长时间处于强光环境使性腺轴的正常分泌功能受到影响，另一方面可能是卵巢-垂体-下丘脑之间相互影响，通过负反馈机制作用，相互作用，造成大鼠体内激素（雌二醇、FSH、LH）的改变。激素FSH和LH会相互作用，并有助于卵泡的成熟及排卵、参加雌性激素的合成与分泌[11]。因此以上各个环节出现异常均可导致卵巢功能的失调。

有研究证实如果下调TNF-α 在大鼠血清含量及卵巢组织中的表达，有助于对卵巢起保护作用，减缓卵巢功能的下降[12]。IFN-γ 是具有多种免疫调节功能的免疫调节因子，其在生殖腺的主要研究集中在对卵巢衰老功能的作用上[13]。IFN-γ 在机体各级卵泡从卵池中发育到成熟卵泡、排卵以及闭锁整个过程中均参与调节。Russell 等[15]报道卵泡闭锁引起卵巢功能下降，IFN-γ 参与调节一系列与卵泡闭锁有关的细胞因子。IFN-γ 蛋白在卵巢中表达的水平与FSH/LH值呈正相关，提示随着卵巢组织中IFN-γ 蛋白表达的升高，卵巢储备功能下降。另外，IFN-γ 蛋白可能与卵巢颗粒细胞损伤或凋亡有关，其会造成卵巢颗粒细胞的过度衰老及凋亡，进一步加快卵池中卵泡的闭锁，从而造成机体的排卵障碍，引起机体卵巢早衰[14]。本研究结果显示，与对照组比较，不同光照强度干预组TNF-α、IFN-γ 蛋白表达明显升高，其中60 W 光照组、100 W 光照组TNF-α、IFN-γ 蛋白表达水平最高，提示随着光照强度以及时间延长，TNF-α、IFN-γ 蛋白表达的升高可加快大鼠体内卵泡闭锁甚至凋亡。

综上所述，长期的慢性光照应激不仅能影响大鼠内分泌功能，引起大鼠内分泌紊乱，从而造成性激素水平的紊乱，而且能升高卵巢中的TNF-α、IFN-γ 蛋白表达，使其与性激素相互影响，引起卵巢功能下降，造成卵巢早衰。