基因组拷贝数变异测序联合短串联重复序列分型在孕早期自然流产病因分析中的应用

张 倩, 吴 东, 肖 海, 李新蕊, 崔 彬, 张梦汀, 张晓梅,侯巧芳, 廖世秀

1)河南省人民医院医学遗传研究所 郑州 450003 2)河南省遗传性疾病功能基因组重点实验室 郑州 450003 3)郑州大学人民医院 郑州 450003

自然流产(spontaneous abortion，SA)是导致不良妊娠结局的最常见原因之一，一般认为在28个完整孕周内发生的非个人意愿终止妊娠均属于SA[1]。SA增加孕妇再次流产的风险[2]，并且导致多种心理问题，给女性的身心带来巨大伤害的同时，还给家庭增添了较多经济和心理负担。孕早期SA是发生在孕12周以前(孕早期)的自发性流产。引起SA的因素较多，包括遗传物质改变、感染、化学毒性暴露、免疫功能障碍、内分泌失调、产妇疾病和不健康的生活方式等[2-3]。文献[4]报道，将近一半的SA尤其是孕早期SA往往由染色体异常引起。因此孕早期遗传物质检测在查明SA原因以及指导再次妊娠等方面具有重要意义。拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)是基于高通量测序平台的检测技术，具有覆盖范围广、通量高、操作简便等优点，且样本DNA用量少[5]，现逐渐被国内外很多实验室推广使用，其技术也可用于流产组织的遗传物质分析[6]。课题组选取了545例孕早期SA胚胎组织样本，使用CNV-Seq技术对其进行全基因组拷贝数变异(copy number variation，CNV)分析；同时为排除母体污染，对所有样本进行短串联重复序列(short tandem repeat，STR)分型检测，并对一些特殊结果用其他平台进行验证，以探讨CNV-Seq及STR分型联合应用在孕早期SA原因分析上的可行性，现具体报道如下。

1 资料与方法

1.1研究样本2019年1月至2020年3月收集到河南省人民医院遗传研究所就诊的孕12周前发生SA患者的胚胎组织。取标本时同时采集了组织样本父母的外周血用以母体排污以及其他协助诊断，本研究所用的标本均获得孕妇及其家属的知情同意。

1.2样本的处理、DNA提取和纯化在无菌条件下，将收集到的胚胎组织进行解剖，从绒毛膜绒毛区域中仔细挑选可用的绒毛组织，取绿豆大小样本，用磷酸盐缓冲液彻底清洗3次，以最大限度地减少母体细胞污染。于-20 ℃冰箱中保存。使用DP304-03基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)进行DNA提取。使用Genomic DNA Clean & ConcentratorTM纯化浓缩试剂盒(ZYMO)对通过质控的DNA进行纯化。纯化后进行Qubit定量，Clean_Q30≥80%且Uniq Reads≥2 500 000为质控合格样本。将获得的DNA样本调整至10～60 mg/L供STR分型检测和DNA文库建库使用。

1.3CNVs检测

1.3.1 DNA文库的构建、定量和CNV-Seq检测 把质控合格的DNA使用CNV-Seq检测试剂盒(可逆末端终止测序法，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司)进行文库构建。具体操作包括在DNA中加入核酸内切酶，把基因组DNA随机酶切后，将酶切产物的DNA末端补平，通过增加一个腺嘌呤脱氧核苷酸使得其与测序引物相连后获得文库DNA，并使用高通量测序文库构建DNA纯化试剂盒(磁珠法，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司)进行DNA文库纯化。将纯化过的产物稀释后使用qRT-PCR进行定量，根据DNA文库浓度的大小调整每个样本加入混合上样体系的体积，将混合体系再次定量以确定最终上机的终浓度，调整上机体积后使用NextSeq CN500(Illumina)基因测序仪检测。

1.3.2 生物信息学分析 以片段拷贝数(segment copy number，SCN)的数值作为判定染色体检测区拷贝数的依据。将测序得到的reads与hg19参考基因组进行比对，对参考基因组进行区间划分，统计每个区间上的唯一比对数，并计算其与阴性对照中该区域唯一比对数的比值，之后采用GDSW算法鉴定染色体异常或CNVs。结果与DECIPHER、DGV、OMIM等数据库进行比对。

1.4STR分型检测把质控合格的DNA样本加入配置好的GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统20A试剂盒(北京基点认知技术有限公司)扩增体系中进行扩增；使用ABI 3500基因分析仪将获取的扩增产物进行毛细管电泳后获得不同分型的相对定位，使用Gene Mapper软件对检出的不同分型进行分析。

1.5单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)验证使用Affymetrix CytoscanTM750 k芯片进行CNV检测分析。通过对质控合格的基因组DNA酶切、连接、扩增之后，将产物纯化、片段化、标记，最后进行杂交和扫描，将得到的数据使用ChAS 3.0系统进行分析，结果与DECIPHER、DGV、OMIM等数据库进行比对。

2 结果

545例孕早期SA胚胎组织全部获得了CNV-Seq检测和STR分型结果。两种平台联合应用共检出遗传物质异常样本300例，阳性率为55.1%。其中，三倍体样本为190例(34.9%)，性染色体单体样本为39例(7.2%)，其他非整倍体型样本9例(1.7%)。通过联合STR分型额外检出异常样本39例，包括三倍体样本30例，单亲二倍体样本6例，其他异常样本3例。所有分类详见表1。使用SNP-array平台对STR分型检出的6例单亲二倍体样本进行验证，验证结果支持STR分型结果(图1)。

A：STR分型示意图，结果显示标本2、3、4、5、6、7、8、11、12、13、15、16、18、19以及21号染色体上STR基因座均为纯合；B：SNP-array提示该标本存在杂合性缺失

表1 CNV-Seq与STR分型联合检测结果

续表1

另外，在23例样本中检出了SA的CNVs，其中15例样本中存在两个以上CNVs，12例样本同时存在基因组片段微重复和微缺失(表2)。对于高度怀疑为平衡易位的样本(序号21)，对其父母进行了染色体核型分析，该样本2号染色体的p25.3至p13.3区存在68.74 Mb重复，11号染色体的q25区存在3.42 Mb缺失；染色体核型分析结果显示其父亲为46,XY,t(2;11)(p13;q25)的染色体平衡易位携带者(图2)。

表2 CNV-Seq技术检出的可能为导致孕早期SA的23例样本的CNVs

A：表2中序号21样本的CNV-Seq检测结果，示2号染色体短臂末端存在68.74 Mb重复，11号染色体长臂末端存在3.42 Mb缺失；B：胚胎父亲的染色体核型分析结果为46, XY, t(2;11)(p13;q25)

3 讨论

SA属于妊娠常见的并发症[7]。20世纪70年代到90年代，美国和中国的SA发生率都在逐步增加[8-9]。多年来行业一直以染色体核型分析作为诊断染色体畸变的金标准，但由于其分辨率较低、细胞培养周期长等原因，尤其是针对流产组织样本容易培养失败的特点，仅靠核型分析已逐渐不能满足临床检测需求[10]。临床亦常用染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)这种比染色体核型检测分辨率高的技术进行全基因组CNV检测，主要用于检测常规染色体核型方法无法检出的微小基因片段的重复和缺失，尤其是小于5 Mb的片段的重复缺失[11]。但CMA技术的检测成本较高且通量较小，对于批量检测流产组织CNV具有一定的限制性，并且CMA技术对样本DNA的质控要求相对较高，使用芯片的杂交探针位置分布相对有限且固定，对于基因组CNV的检测的不够灵活。基于以上原因，作者使用了基于二代测序的CNV-Seq平台，其除了与CMA技术同样可以覆盖整个基因组进行检测之外，还具有更多优势：首先CNV-Seq检测的是被酶切随机打断的基因组片段，测序更具有随机性；其次，CNV-Seq技术的分辨率更高，基因组上每20 kb就有一个检测位点，可检出100 kb以上的CNVs，检测结果精度更高[5]；另外，相比CMA芯片检测，一次可完成更多的样本检测，节省时间和成本，在经济角度上的可选择性较高。因此CNV-Seq技术被逐渐推广应用于临床。本研究对于已检出的高度怀疑为平衡易位的样本进行了父母的染色体核型分析验证，结果发现5例胚胎组织的父母中存在平衡易位携带者，这些检测分析为本次妊娠不良查明了原因，也为他们以后再次妊娠提供了遗传学的风险评估。另外，作者在24例样本中检的CNVs，通过分析父母来源、区域内包含基因以及数据库等判断为临床意义不明确。

但CNV-Seq技术本身也有其局限性，其对于多倍体、染色体易位重排倒位、特殊嵌合体、单亲二倍体等样本有无法检出的缺点，所以在对流产组织进行CNV检测时需要一些辅助检测手段来帮助结果分析。本研究选择了545例早期SA胚胎组织进行CNV-Seq检测，联合STR分型对实验结果进行分析，正是出于CNV-Seq技术的局限性这一情况考虑的结果。CNV-Seq技术对于三体样本的检出率很高，对于CNV-Seq技术不能检测出的多倍体以及单亲二倍体等样本，通过STR分型可获得良好分析。69,XXY和69,XYY型样本在CNV-Seq平台上表现为X染色体和Y染色体嵌合，69,XXX则与46,XX型样本的结果相同，但通过STR分型则可以较清楚地分辨出这些样本的染色体数目。同样，单亲二倍体在CNV-Seq平台上的检测结果与46,XX型样本的结果相同，但STR分型则可以轻易分辨出其检测位点均为杂合性缺失。作者进一步应用SNP-array平台对疑似单亲二倍体的样本进行了检测，结果与应用STR分型分析的结果一致。

本研究检出异常染色体样本阳性率为55.1%，与既往研究[6,12]中检出的阳性率以及染色体变异方式较为一致。两种技术联合应用诊断阳性率比单独应用CNV-Seq平台诊断的阳性率提高了7.2%。这说明对于早期SA胚胎组织检测来说，虽然CNV-Seq技术诊断效率较高，但STR分型分析对于早期SA原因的分析也是必要的。因此以CNV-Seq为主，STR分型联合检测这一方法在早期SA胚胎的病因分析中的应用是非常有价值的。