p16/Ki67双染、HPV E6/E7 mRNA检测对于TCT检查为低级别鳞状上皮内病变及以下且HPV检测为阴性或其他高危型HPV阳性患者的分流作用

李碧军，郭瑞霞，王春芳，陈 曦，褚丹霞，王凯丽，杜建敏，白 晶

1)郑州大学第一附属医院妇科 郑州 450052 2) 郑州大学第三附属医院妇科 郑州 450052

宫颈癌是威胁全球妇女健康及生命的主要恶性肿瘤之一，目前其发病率占女性恶性肿瘤第4位[1]。近几十年，随着宫颈癌知识的普及和“两癌”筛查的大力推广，我国宫颈癌前病变及早期宫颈癌的检出率逐年提高[2]。宫颈细胞学检查是最早采用的宫颈癌筛查技术，具有较高的特异度，但其诊断敏感度可能因制片方法、染色水平及检测医师阅片水平而降低[3]。目前宫颈细胞学检查主要采用TCT检查。人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)检测对无症状感染者的癌前病变及宫颈癌的早期发现有重要的临床价值，但特异度较低。细胞学联合HPV检查能提高宫颈癌前病变及宫颈癌的检出率[4]，但同时也伴随着高假阳性率及高比例阴道镜转诊率，甚至由于过度干预带来一系列并发症，在育龄期女性尤为严重[5]。因此，一些生物标记物被尝试应用于临床，来分流细胞学结果为轻度异常或其他高危型HPV阳性患者中的高危人群，以便更好地识别真正的高级别病变。p16/Ki67、HPV E6/E7 mRNA即是其中2种新的生物标记物。p16/Ki67是一种能提示HPV转化性感染的联合生物学标志物；HPV E6/E7是宫颈致癌基因，对于宫颈癌前病变的诊断具有较好的特异性，能有效降低其误诊率[6-7]。本文将探讨2种新的检测方法对TCT提示为低级别鳞状上皮内病变(LSIL) 及以下且HPV检测为阴性或其他高危型HPV阳性患者的分流作用。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2018年10月至2019年10月在郑州大学第一附属医院妇科门诊接受宫颈癌筛查的患者资料。纳入标准：①TCT检查为LSIL及以下且HPV检测为阴性或其他高危型HPV阳性(不包括HPV16、18阳性)，包括未见上皮内病变或恶变细胞(NILM)、意义未明的不典型鳞状细胞(ASCUS)、LSIL。②有TCT、高危型HPV、p16/Ki67双染色法(简称双染)、高危型HPV E6/E7 mRNA(简称E6/E7)检测及阴道镜下活检结果。阴道镜活检指征：高危HPV阳性，同时TCT为ASCUS或更高级别病变；高危HPV阳性持续超过12个月，TCT为NILM；高危HPV阴性，TCT为LSIL；高危HPV阴性，TCT为ASCUS持续超过12个月；高危HPV阴性，TCT为NILM，但妇科检查时肉眼观察疑似宫颈癌。排除既往曾接受过治疗的宫颈病变患者，合并其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治疗的患者，合并妊娠的患者。共入组414例，年龄19～70(43.6±12.1)岁，<30岁者63例(15.2%)，≥30岁者351例(84.8%)。

1.2双染检测使用p16/Ki67检测试剂盒(CINtec PLUS 瑞士罗氏公司)，将盛在新柏氏细胞保存液中的宫颈脱落细胞进行程序化处理，制片、染色、封固，加盖玻片，读片。结果判定标准：以同一个细胞中同时出现细胞质棕色染色和细胞核红色染色者为p16/Ki67双染色阳性，否则为阴性。

1.3E6/E7检测利用细胞学检查的剩余细胞液在1周内采用定量检测试剂盒(Quanti Virus 科蒂亚)检测高危型HPV E6/E7 mRNA。结果用相关光单位(relative light units, RLUs)表示，超过发光阈值为阳性。

1.4阴道镜检查及活检病理由专门妇科阴道镜室医师进行阴道镜检查(欧普C5阴道镜)，并对可疑病变部位进行多点活检，由2位病理医师独立阅片。根据2014年WHO女性下生殖道肿瘤分类标准将慢性炎症、LSIL判为阴性；将高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及各种类型的宫颈癌判为阳性。

1.5统计学处理应用MedCalc和SPSS 21.0进行统计学分析。比较不同方法单独或联合检测宫颈HSIL+病变的效能(灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。3种方法联合检测时有2种及以上检测方法为阳性时，诊断为阳性；TCT联合HPV检测时有1种及以上检测方法为阳性时，诊断为阳性(其中HPV检测阳性为任一其他高危型HPV阳性)。采用McNemar检验比较双染和E6/E7检测以及TCT+HPV+双染、TCT+HPV+E6/E7及TCT+HPV检测HSIL+病变的效能，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1双染和E6/E7检测检出宫颈HSIL+病变的结果和效能比较结果见表1、2。阴道镜活检病理结果中慢性炎症156例，LSIL 108例，HSIL120例，鳞状细胞癌21例，腺癌6例，神经内分泌癌3例。以活检病理结果为金标准，HSIL+(HSIL和癌)患者占36.2%(150/414)，LSIL及以下(LSIL和慢性炎症)患者占63.8%(264/414)。双染检出HSIL+96例，E6/E7检出90例。

表1 双染和E6/E7检测检出宫颈HSIL+病变的结果比较 例

2.2联合检测检出HSIL+病变的结果和效能比较结果见表3～6，TCT+HPV+双染检出HSIL+118例，TCT+HPV+E6/E7检出111例，TCT+HPV检出135例。

表2 双染和E6/E7检测检出宫颈HSIL+病变的效能比较 %

表3 联合检测检出宫颈HSIL+病变的结果比较 例

表4 TCT+HPV+双染和TCT+HPV+E6/E7检出宫颈HSIL+病变的效能比较 %

表5 TCT+HPV+双染和TCT+HPV检出宫颈HSIL+病变的效能比较 %

表6 TCT+HPV+E6/E7和TCT+HPV检出宫颈HSIL+病变的效能比较 %

3 讨论

根据指南[8]推荐，对细胞学结果为ASCUS者，进行高危HPV检测，结果阳性者推荐阴道镜检查，阴性者则继续常规筛查；对结果为LSIL者，直接行阴道镜检查。但由于ASCUS中高危HPV的阳性率较高，因此大量患者被推荐阴道镜检查。但ASCUS中仅有15%、LSIL中仅有12%～28%的患者经组织学活检证实为HSIL+，造成大量的过度诊疗[9]。HPV16阳性(有或无HPV18阳性)、其他高危型HPV 阳性和高危型HPV阴性妇女中发生HSIL+的比例分别为11.4%、6.1% 和0.8%[10]。由于大众对宫颈癌的过度恐慌，出现其他高危型HPV阳性或TCT轻度异常(ASCUS、LSIL)时可能有焦虑情绪，由此会产生一系列的过度检查和治疗。

有研究[11]表明，抑癌基因p16及增殖细胞核抗原Ki67活性与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，在宫颈病变的诊断中是很有意义的标志物。90%以上的HSIL+中P16蛋白呈现高表达，而在LSIL和慢性炎症中常为局灶弱阳性或阴性表达[12]。在生理条件下,同一细胞内P16和Ki67蛋白的表达应当彼此排斥，当P16与Ki67蛋白在同一宫颈上皮细胞中同时检出时，则提示细胞周期循环被破坏，细胞异常增殖，可作为提示HSIL+的指标[13]。国内外均有研究[6,12，14]表明，p16/Ki67双染在宫颈癌筛查中表现出较高的灵敏度和特异度。Bergeron等[15]以及Atkins等[16]的研究均发现，在TCT检查结果为ASCUS或LSIL的患者中，p16/Ki67双染发现HSIL+的敏感度均与HPV检测相似，但p16/Ki67双染有着较高的特异度。但也有研究[17]指出，p16/Ki67双染灵敏度较低，不能确保一些HPV持续感染者不被漏诊。金蓉蓉等[18]、于静等[19]研究发现p16/Ki67双染在分流ASCUS/LSIL患者中有较好的筛查效能。Wright等[20]研究发现p16/Ki67在分流其他12种HPV高危阳性患者中具有重要作用。

众所周知，HPV感染是宫颈癌的主要危险因素，而HPV E6/E7蛋白的表达水平与宫颈病变的进展程度及细胞的恶性转化密切相关，HPV E6/E7 mRNA可能成为筛查HSIL+的有效指标。李晓林等[7]发现HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变检出中具有较高的敏感度与特异度，在宫颈病变筛查中具有潜在应用价值。有研究[21]发现HSIL+组的 HPV E6/E7 mRNA 阳性率高于LSIL 组。HPV E6/E7 mRNA阳性提示癌基因正在转录期，对于这类患者是否应加强随访，进行3～5 a的密切随诊，及是否能预测LSIL的转归，仍有待进一步证实。

本研究收集了414例TCT检查为LSIL及以下且HPV检测为阴性或其他高危型HPV阳性(不包括HPV16、18阳性)的患者，发现p16/Ki67双染和HPV E6/E7检测的灵敏度相近，均在60%左右，但双染特异度高于HPV E6/E7；联合检测发现，TCT+HPV+双染检测灵敏度略低于TCT+HPV检测，但特异度较高，与上述文献相符。说明在筛查时联合双染检测，不仅保持了较高的灵敏度，还提高了筛查的特异度。但本研究尚存在一定局限性：首先，入组病例数还不足，需要多中心、大数据再进行验证；其次，进行双染制片时存在细胞数量过少、细胞稀疏和细胞团块等，导致制片效果差；同时由于阅片时过于保守，导致双染结果假阴性较多。本研究中TCT联合HPV的筛查效能较低，可能与研究样本不同有关，排除了许多HPV其他阳性或TCT结果为LSIL及以下但未进行活检的患者，造成本研究中HSIL+例数过高。目前尚无研究证实p16/Ki67双染对除宫颈鳞癌外其他类型病变的检出作用，如宫颈腺癌、神经内分泌癌等特殊类型的病变。本研究中共有9例宫颈腺癌和宫颈神经内分泌癌，而p16/Ki67的结果均为阴性。由于样本量较小，具体结论应扩大样本量后进一步验证。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki67表达与宫颈高级别病变密切相关，在TCT检查为LSIL及以下且HPV检测为阴性或其他高危型HPV阳性患者中，再联合p16/Ki67检测分流，不仅能保持较高的灵敏度还能提高特异度，从而提高筛查效能，降低阴道镜转诊率，避免过度诊疗。