氧化苦参碱对糖尿病大鼠骨代谢及CREB/CRTC1信号通路的影响

张 莹,李青菊,李江雁,吴苏豫,周艳红

1)新乡市中心医院内分泌科 河南新乡 453000 2)郑州大学第二附属医院内分泌科 郑州 450014

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰岛β细胞功能下降或胰岛素分泌障碍导致的一种代谢性疾病[1]。据统计，全世界已有3.82亿糖尿病患者，估计到2035年将上升至5.92亿[2]。糖尿病是导致骨量降低的因素之一，高血糖会破坏胶原蛋白的翻译后修饰，如酶促不成熟和成熟的交联以及非酶促高级糖基化终产物的形成，从而破坏骨组织结构[3-4]。骨骼作为一种代谢活跃的器官，其消除量与合成新骨量处于平衡状态。某些病理状态引起的骨骼重塑失衡会导致代谢性骨疾病的发生，例如骨质减少和骨质疏松症[5]。目前，糖尿病相关的骨代谢异常和骨骼微结构变化越来越受到关注。

氧化苦参碱(oxymatrine，OMT)是苦参的主要成分喹嗪生物碱。OMT具有抗炎、抗癌和抗病毒等多种作用，可诱导肿瘤细胞周期停滞和凋亡，并抑制细胞活性、侵袭、迁移、血管生成和上皮间质转化[6-8]。Zuo等[9]研究发现OMT可以调节糖尿病大鼠肝脏组织中KSRP、PTEN 及AKT的表达，从而改善糖尿病大鼠的肝功能。Wang等[10]报道指出OMT能够有效预防糖尿病神经病变的发生，改善糖尿病大鼠的认知功能，其作用机制与减少海马组织氧化应激，抑制NF-κB 信号通路和Caspase-3 活性，抑制神经细胞的凋亡等相关。此外，也有研究[11]表明OMT可提高胰岛素释放并增加胰岛素敏感性来降低糖尿病大鼠的血糖。本研究进一步探讨OMT对糖尿病后骨代谢相关指标的影响。

1 材料与方法

1.1动物与主要试剂40只清洁级健康雄性SD 大鼠，6～7周龄，体重180～210 g，购于北京维通利华实验技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK (京)2012-0001。

链脲佐菌素(streptozocin，STZ)、OMT购自美国Sigma公司，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、甲醛、EDTA购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)、骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、骨钙素(OC)ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，BCA蛋白试剂盒、血清钙磷检测试剂盒(邻甲酚酞络合铜比色法)购自上海羽朵生物科技有限公司，Trizol试剂购自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液、SDS-PAGE 凝胶、ECL显色液、HE染色试剂盒及免疫组化染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，兔抗骨钙蛋白(OCN)、兔抗p-活化的cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、兔抗t-CREB、兔抗转录共激活因子1(CRTC1)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Abcam 公司，鼠抗β-actin购自美国Santa Cruz 公司。

1.2实验分组大鼠适应性喂养1 周，自由进食、饮水。将40只大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组、OMT低剂量组、OMT高剂量组，每组10只。糖尿病模型组和OMT低、高剂量组大鼠空腹24 h后腹腔内注射60 mg/kg的STZ，2 d和7 d后尾静脉采血，使用罗氏血糖仪测定大鼠血糖，当两次血糖均≥16.9 mmol/L判定为糖尿病模型构建成功。正常对照组大鼠同时注射等体积的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。3组均建模成功，且建模过程中无大鼠死亡。

模型建立成功1周后，OMT低、高剂量组分别给予100、200 mg/kg OMT灌胃，正常对照组、糖尿病模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，均连续灌胃 7 d。给药结束24 h后，取血样测定各指标。4周后，断颈处死大鼠，摘取左侧股骨，一部分甲醛固定，一部分置于-80 ℃中保存。

1.3血清钙、磷和24h 尿钙检测给药结束24 h后，留取大鼠24 h 尿液，记录尿量。并通过尾静脉取血，3 000 r/min低温离心20 min，静置后收集分离上层血清。采用邻甲酚酞络合铜比色法检测血清钙、磷水平和24 h尿钙水平。

1.4血清CTX-Ⅰ、OC与BSAP水平测定取分离的上层血清，ELISA法测定血清CTX-Ⅰ、骨钙素OC及BSAP含量，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5骨密度检测将大鼠左侧股骨沿平台长轴放置，使用Osteocore3 Digital 2D 双能X射线骨密度仪进行扫描，测定股骨骨密度。

1.6股骨组织中ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA的qRT-PCR检测将股骨敲碎并加入Trizol试剂进行研磨，提取总RNA，经紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。利用Prime ScriptTMRT reagent Kit将RNA反转录为cDNA，qRT-PCR法检测股骨组织中ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA 的表达情况，以β-actin为内参基因。扩增体系包括：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，添加无酶水补足25 μL。扩增条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，40个循环。使用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见表1。

表1 引物序列

1.7股骨组织病理形态学观察取出固定的股骨组织，置体积分数10%EDTA溶液15 d左右进行脱钙，隔天换液1次，直至骨组织变软。梯度乙醇脱水，将已固定好的骨组织块置于融化的石蜡中浸蜡与包埋，3～5 μm厚 切片。HE染色，光学显微镜下观察骨组织形态学改变。

1.8股骨组织OCN蛋白表达的检测采用免疫组化SP法。将制备好的股骨石蜡切片脱蜡脱水后，柠檬酸钠抗原修复3 min，PBS 冲洗后加入体积分数3% H2O2溶液处理10 min，阻断内源性过氧化物酶，加入山羊血清封闭液，于湿盒中室温封闭10 min。然后加入兔抗OCN(按照1∶100稀释)，4 ℃下孵育过夜。次日PBS 冲洗后，加入链霉素菌抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10 min，PBS 冲洗，DAB 显色2 min。苏木精复染，分化后自来水下冲洗，晾干后中性树胶封片，光学显微镜下观察并进行图像采集与分析。

1.9股骨组织中p-CREB、t-CREB、CRTC1蛋白表达的Western blot检测将股骨敲碎研磨至粉末状，加入含蛋白酶抑制剂(PMSF)的 RIPA裂解液进行裂解，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取25 μg蛋白样品上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，将分离蛋白转至硝酸纤维素膜上，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗p-CREB (按照1∶1 000稀释)、兔抗t-CREB (按照1∶1 000稀释)、兔抗CRTC1(按照1∶100稀释) 以及鼠抗β-actin (按照1∶1 000稀释)一抗，4 ℃下孵育过夜，次日TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(按照1∶5 000稀释)，常温孵育2 h，TBST再次洗膜，滴加ECL液显色，凝胶成像系统中曝光拍照，Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.10统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，4组各指标比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠血清钙、磷水平及24尿钙和24h 尿量比较与正常对照组比较，糖尿病模型组、OMT低剂量组和OMT高剂量组大鼠24 h 尿钙和尿量显著升高(表2)。

表2 各组大鼠血清钙、磷水平及24 h 尿量、尿钙比较(n=10)

2.2各组大鼠血清CTX-Ⅰ、OC、BSAP水平比较与正常对照组比较，糖尿病模型组、OMT低剂量组和OMT高剂量组大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC、BSAP的含量显著增加；与糖尿病模型组比较，OMT高剂量组与OMT低剂量组血清中CTX-Ⅰ、OC、BSAP的含量显著下降(表3)。

表3 各组大鼠血清CTX-Ⅰ、OC、BSAP含量比较(n=10) mg/L

2.3各组大鼠骨密度与ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA表达比较与正常对照组比较，糖尿病模型组、OMT低剂量组和OMT高剂量组骨密度降低，ALP、OPG的mRNA表达显著下调，CEBP、RANKL 的mRNA表达显著上调；与糖尿病模型组比较，OMT低、高剂量组骨密度增加，ALP mRNA的表达显著上调，CEBP、RANKL mRNA的表达显著下调，与OMT低剂量组比较，OMT高剂量组OPG mRNA表达上调(表4)。

表4 各组大鼠骨密度与ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA表达水平比较(n=10)

2.4各组大鼠骨组织病理形态学正常对照组可见股骨骨小梁数目多、排列整齐、未见吸收或者断裂现象，松质骨间充满红骨髓；糖尿病模型组大鼠骨小梁明显减少、排列稀疏、变细、有断裂现象，骨髓腔内未见明显骨髓细胞；OMT低、高剂量组大鼠较糖尿病模型组骨小梁数量有所增加，排列较规则，连续性较好，骨髓腔内可见骨髓细胞，且高剂量组改善效果更为明显，见图1。

A、B、C、D：分别为正常对照组、糖尿病模型组、OMT低剂量组和OMT高剂量组

2.5各组大鼠OCN蛋白表达比较与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠股骨中OCN蛋白表达显著降低；OMT低、高剂量组中OCN蛋白表达较糖尿病模型组显著升高，见图2与表5。

A、B、C、D：分别为正常对照组、糖尿病模型组、OMT低剂量组和OMT高剂量组

2.6各组大鼠股骨中CREB/CRTC1信号通路相关蛋白表达的比较与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠中p-CREB和CRTC1蛋白表达水平显著上调；与糖尿病模型组比较，OMT高剂量组p-CREB、CRTC1蛋白表达水平显著下调，见图3与表5。

1～4分别为：正常对照组、糖尿病模型组、OMT低剂量组和OMT高剂量组

表5 各组大鼠股骨中OCN、p-CREB、t-CREB、CRTC1蛋白表达水平比较(n=10)

3 讨论

糖尿病发病率逐年增加，现已严重威胁到人类健康[2]。糖尿病发生后，会引起一系列并发症如肝损伤、肾损伤、视网膜疾病及心血管系统损伤等的发生。此外，糖尿病通过影响骨代谢导致骨质疏松的发生，其并发症如骨质疏松症性疼痛和骨折也严重危害患者的生活质量，并给患者带来沉重的经济负担[4,12]。建立糖尿病动物模型是深入研究糖尿病及其并发症的基础，注射STZ是目前常用于该模型构建的方法[13]。高血糖是糖尿病的主要特征[14]，本研究中糖尿病模型组和OMT低、高剂量组大鼠血糖均大于16.9 mmol/L，说明模型构建成功。

本研究结果显示糖尿病大鼠血清钙、磷指标无明显改变，24 h 尿量与24 h 尿钙增加，说明钙丢失增多。而OMT干预对24 h 尿量与24 h 尿钙水平均无显著影响，提示糖尿病大鼠的 24 h 尿钙水平可能是受多种因素综合影响的结果。骨组织处于骨重建的动态变化之中，其中骨形成和骨吸收是骨代谢中两个联系密切的过程[15]。OC与BSAP是骨形成的特异而敏感的标志物，CTX-Ⅰ是骨吸收特异标志物[13,16]。本研究结果显示OMT低、高剂量组大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC、BSAP含量明显降低。同时，糖尿病大鼠骨密度下降，骨小梁明显减少，且变细、断裂，提示其出现了一定程度的骨质疏松，而OMT干预使股骨组织病理形态得以改善，骨密度也有所增加。

ALP作为细胞表面的一种糖蛋白，与骨骼的钙化作用密切相关[17]，CEBP 为脂肪细胞分化过程中重要的转录因子[18]。OPG与RANKL分别是肿瘤坏死因子受体家族成员与肿瘤坏死因子配体超家族成员，两者组成 OPG/RANKL通路参与调节破骨细胞分化过程[19]。本研究结果显示，与糖尿病模型组比较，OMT干预后ALP、OPG mRNA表达较糖尿病模型组明显上调，而CEBP、RANKL mRNA表达下调，OCN蛋白表达增加。以上结果说明OMT干预可促进糖尿病大鼠骨生成，骨吸收被抑制，表明了OMT可能具有减弱糖尿病大鼠破骨细胞功能，降低骨吸收的能力。

目前，糖尿病导致骨质疏松的机理尚未完全阐明。CREB可通过与靶标cAMP反应元件的结合，从而激活下游相关基因的转录。CRTC1可显著增加CREB的转录活性[18]。大量研究[20-21]表明，转录因子CREB在各种炎症、疼痛性疾病中起着至关重要的作用，而抑制CREB/CRTC1信号通路可以起到明显的镇痛作用。本研究结果显示，高剂量OMT干预的大鼠骨组织中 p-CREB、CRTC1蛋白表达水平较糖尿病模型组下调，说明OMT可能通过抑制了CREB/CRTC1信号通路改善糖尿病大鼠骨组织病变现象。

本文不仅指出糖尿病存在骨质疏松症的潜在危险，还表明了OMT可以通过抑制CREB/CRTC1信号通路的激活改善糖尿病大鼠中骨形成与骨吸收之间的失衡现象，发挥对骨组织的保护作用。本研究为加快OMT治疗糖尿病及其并发症的临床转化提供了实验依据。但OMT的保护作用是否涉及胰岛素抵抗相关通路共同上游靶标的调节还有待进一步探讨。